本文關鍵詞：肝癌HepG2細胞TAB182基因沉默穩(wěn)定細胞系的建立及其化療敏感性的研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是一種惡性程度高、治愈率低的臨床常見惡性腫瘤,居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第六位,病死率的第三位。目前治療肝癌的手段包括多種,如手術、放療、化療、分子靶向療法、肝動脈化療栓塞以及中醫(yī)治療等�；瘜W治療仍是治療中晚期肝癌的重要手段。雖然不斷有新的化療藥物和化療方案推出,但是由于化療耐藥基因存在,使得化療藥物的療效存在很大的局限性,進而導致癌癥的復發(fā)與轉(zhuǎn)移。近年來,隨著分子生物學理論和基因重組技術的成熟,有關肝癌耐藥基因的研究層出不窮,化療聯(lián)合基因治療顯示出廣闊的應用前景。TAB182,又稱TNKS1BP1,是在通過酵母雙雜交試驗研究與多聚ADP核糖聚合酶家族成員TNKS1的相互作用蛋白中首次被發(fā)現(xiàn)的。本實驗室前期在大規(guī)模識別鑒定DNA雙鏈斷裂信號響應與修復的關鍵調(diào)節(jié)分子DNA-PKcs的磷酸化底物中發(fā)現(xiàn):TAB182可能參與電離輻射誘發(fā)DNA損傷應激與信號響應的調(diào)控,進一步研究發(fā)現(xiàn)TABl82基因沉默的細胞放射敏感性增加;TAB182能夠調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂活化非同源末端連接信號通路,并且參與細胞周期進程的調(diào)節(jié)。DNA或DNA代謝過程會因放射線及多種抗癌藥物的作用而受到直接或間接的影響,DNA受損后繼發(fā)DNA損傷修復,而對DNA的修復結(jié)果就是使細胞生存率提高,基于這一原理,只要對DNA損傷修復過程加以抑制,就可以使細胞化療敏感性提高。順鉑是肝癌臨床治療中常見化療藥物。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物,除了具有胰島素增敏、降糖等作用,流行病學發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以降低糖尿病患者罹患肝癌的風險,并改善肝癌的預后。近期多項細胞、動物實驗均提示二甲雙胍可抑制肝癌的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移,可能與促進細胞凋亡與周期阻滯和減少DNA損傷有關,但其具體機制還需進一步深入探討�；诖�,筆者設想,TAB182基因參與DNA損傷修復,增加腫瘤細胞放療敏感性,那么,沉默TAB182是否可以提高作用于DNA的化療藥物腫瘤殺傷效果?為此,本研究以脂質(zhì)體為載體,轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞,通過sh RNA技術調(diào)控TAB182的表達,篩選出TAB182蛋白穩(wěn)定沉默的細胞,采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)方法研究HepG2細胞TAB182基因沉默后對肝癌相關化療藥物敏感性的影響,為進一步探索篩選肝癌的靶向基因治療提供依據(jù)。方法:1本課題選擇離體肝癌HepG2細胞作為研究對象,利用脂質(zhì)體2000介導基因轉(zhuǎn)染的技術轉(zhuǎn)染HepG2細胞,建立TAB182基因沉默細胞模型,通過潮霉素B篩選,建立TAB182基因沉默的單克隆HepG2細胞系,即HepG2-sh-TAB182細胞系。HepG2-NC作為陰性對照,也就是把和人類編碼基因不存在同源性的載體或片段與轉(zhuǎn)染細胞相連接。2通過Western blot的方法檢測HepG2-sh-TAB182細胞及HepG2-NC細胞TAB182蛋白表達情況。3通過CCK-8實驗檢測不同濃度順鉑(1、2、4、8μg/m L)、二甲雙胍(5、10、20、40 mmol/L)在不同作用時間(24h、48h和72h)下對HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC細胞增殖抑制作用的差異與特征規(guī)律,并繪制相應的作用曲線。4采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行實驗數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。兩獨立樣本采用t檢驗,P0.05視為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果:1經(jīng)Western blot技術檢測顯示:轉(zhuǎn)染TAB182基因沉默sh RNA質(zhì)粒的肝癌HepG2細胞,TAB182蛋白不表達,TAB182基因沉默穩(wěn)定細胞系成功建立。2 CCK-8增殖實驗表明:1)順鉑、二甲雙胍作用于HepG2-sh-TAB182細胞及HepG2-NC細胞,隨著藥物濃度增加及作用時間的延長,各組HepG2細胞增值抑制率逐漸增高,差距具有統(tǒng)計學意義(P0.05);2)給予順鉑、二甲雙胍處理,在相同作用濃度及作用時間下,HepG2-sh-TAB182細胞與HepG2-NC相比,細胞增殖抑制率顯著增高,差距具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1本研究成功構建了肝癌HepG2細胞TAB182基因沉默穩(wěn)定細胞系(HepG2-sh-TAB182細胞系)。2抑制TAB182基因表達能增加肝癌HepG2細胞對順鉑的藥物敏感性,其機制有待進一步研究;3二甲雙胍具有抑制肝癌HepG2細胞增殖作用,抑制TAB182基因表達能增加肝癌細胞對二甲雙胍的藥物敏感性,其機制有待進一步研究。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 Roberto Mazzanti;Umberto Arena;Renato Tassi;;Hepatocellular carcinoma: Where are we?[J];World Journal of Experimental Medicine;2016年01期

2 王端明;王敬晗;李林芳;陳靜波;蘇長青;;針對Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體的構建及其對肝癌細胞的抑制作用[J];生物工程學報;2012年05期

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本文編號：1352525