發(fā)布時間：2017-12-22 05:06

  本文關(guān)鍵詞：未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)信號分子在DLBCL中的表達及意義的研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)是一種細胞自我保護性應(yīng)答反應(yīng)。在細胞遭受影響蛋白質(zhì)折疊的不利條件時,錯誤折疊與未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集,影響細胞的正常生理功能。UPR通過增加細胞蛋白質(zhì)折疊能力,重塑分泌通路以適應(yīng)生長需要和環(huán)境改變,使細胞功能恢復(fù)正常并使之存活。近年來的研究提示,UPR通路的活化在B細胞正常發(fā)育或惡性轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),某些UPR信號分子的活化能誘導(dǎo)B淋巴瘤細胞啟動保護性自噬,促進細胞的存活；也有研究表明UPR相關(guān)基因PRDM1在彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)ABC亞型中扮演腫瘤抑制因子的角色。因此,關(guān)于UPR在DLBCL中的研究尚存爭議。本研究旨在對UPR相關(guān)分子和下游活化通路進行整合分析,探索其在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中的作用及與DLBCL預(yù)后的相關(guān)性,為DLBCL的預(yù)后評估和治療提供科學(xué)依據(jù)。首先,我們通過免疫組織化學(xué)法檢測兩個重要的UPR通路分子IRE1α和PERK磷酸化蛋白(IRE1α-pS724和PERK-pT981)的表達水平。我們發(fā)現(xiàn),在實驗組DLBCL臨床組織樣本中IRE1α-pS724, PERK-pT981的中/高度表達水平分別為78.57%(121/154)和66.88%(103/154),明顯高于對照組正常淋巴組織樣本的36.67%(11/30)和23.33%(7/30)。通過對DLBCL患者進行臨床特征回顧性分析和預(yù)后隨訪,截止至2015年10月31日,中位隨訪時間為39月(1月-65月)有71例患者死亡,病死率為46.10%。預(yù)后分析顯示, IRE1α-pS724和PERK -pT981高表達可能是患者預(yù)后不良的指標(biāo)(P=0.0054,P=0.0386)。接下來,采用免疫印跡法分別對實驗組8株DLBCL細胞系和對照組正常健康捐贈者的外周血B淋巴細胞,進行UPR相關(guān)分子BiP, ATF6, IRE1α, PERK以及它們的磷酸化蛋白表達水平的檢測。我們發(fā)現(xiàn),上述UPR相關(guān)分子在DLBCL細胞株中的表達水平均高于普通B細胞。由此可知,在DLBCL細胞中存在UPR通路的基本活化。進而,我們用ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(TG)刺激DLBCL細胞OCI-LY10和SU-DHL-4,發(fā)現(xiàn)在DLBCL細胞系中,ATF6, IREla, PERK和eIE2a的磷酸化蛋白表達水平隨著TG刺激時間(0h,12h,24h,36h)的增加而持續(xù)升高。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗,發(fā)現(xiàn)TG刺激并不能誘導(dǎo)DLBCL細胞發(fā)生凋亡,但相同處理能夠誘導(dǎo)對照組細胞HEK293發(fā)生凋亡,同時免疫印跡結(jié)果提示,HEK293細胞中UPR下游信號分子ATF4和促凋亡分子CHOP的表達水平升高。通過CO-IP試驗,我們發(fā)現(xiàn)TG處理組和對照組細胞中ATF6-BiP、IREla-BiP以及PERK-BiP復(fù)合物均不發(fā)生解離；共聚焦顯微鏡下ATF6, p-IRE1α, p-PERK三者和Bip共定位。根據(jù)以上結(jié)果,我們構(gòu)建了ATF6, IRE1α和PERK慢病毒敲低載體,分別感染OCI-LY10和SU-DHL-4細胞。我們發(fā)現(xiàn),TG刺激能誘導(dǎo)ATF6, IRE1α敲低的細胞發(fā)生凋亡；PERK敲低的細胞,TG刺激對其凋亡并無明顯誘導(dǎo)作用；將ATF6和IRE1α敲低的細胞穩(wěn)株,再次進行PERK敲低,則TG組細胞凋亡率比PERK未敲低時明顯下降。免疫印跡結(jié)果提示,ATF6或IRE1α敲低的細胞,TG刺激后ATF4和CHOP的表達水平明顯增高；ATF6或IREla和PERK雙敲低的細胞,TG刺激后ATF4和CHOP的表達水平比對照組略有增高,但差異并不明顯。綜上所述,在DLBCL中存在UPR信號通路的持續(xù)活化,該通路的活化不依賴于ERS的誘導(dǎo),且能對抗ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡。在對抗ERS誘導(dǎo)的DLBCL細胞凋亡中,ATF6和IRE1α信號分子起重要作用,促進腫瘤細胞的存活,具體分子調(diào)控機制還有待進一步探索。PERK激活的CHOP途徑則在誘導(dǎo)細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究還發(fā)現(xiàn),IREla和PERK的高活化水平可能是DLBCL患者預(yù)后不良的指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1

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本文編號：1318523