本文關(guān)鍵詞：復(fù)制選擇性腺病毒在肺癌CTCs檢測(cè)中的應(yīng)用　出處：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的中國腫瘤登記中心2015年報(bào)數(shù)據(jù)顯示,肺癌在我國男性癌癥患者中發(fā)病率占據(jù)第一位,女性患者中位居乳腺癌之后占據(jù)第二位,死亡率均占據(jù)第一位,其五年生存率為16.1%。2016年國家癌癥中心在《CA Cancer J Clin》發(fā)布的2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,整體上肺癌是發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)目前定義為自發(fā)或因診療操作過程中由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。越來越多的證據(jù)顯示,CTCs作為一種“液體活檢”在肺癌復(fù)發(fā)的早期監(jiān)測(cè)、療效及預(yù)后的評(píng)估、個(gè)體化治療等方面具有重大作用[1]。檢測(cè)方法的發(fā)展使得CTCs的檢出越來越可行,不斷涌現(xiàn)的不同的富集及檢測(cè)技術(shù)多依賴于腫瘤細(xì)胞的物理學(xué)(大小、密度、變形性等)及生物學(xué)(膜蛋白等)特性。如目前唯一被美國FDA通過的Cell Search系統(tǒng)通過包被抗上皮細(xì)胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗體的免疫磁珠與血樣中的癌細(xì)胞免疫結(jié)合而達(dá)到分離的目的,但在一些良性及炎性病變中同樣發(fā)現(xiàn)了假陽性結(jié)果的存在[2],此外肺癌細(xì)胞由原發(fā)灶釋放進(jìn)入循環(huán)時(shí)發(fā)生的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)會(huì)造成EpCAM的下調(diào)甚至不表達(dá),該系統(tǒng)檢測(cè)效率欠佳。實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建的新型的端粒酶特異的復(fù)制選擇性腺病毒Adll-Tel-GFP,在肺癌細(xì)胞中相對(duì)特異的選擇性復(fù)制并表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),在熒光顯微鏡下能夠直接進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù),通過對(duì)細(xì)胞系及臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),探究其靈敏性與特異性,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法健康人全血經(jīng)過裂解紅細(xì)胞,于培養(yǎng)基中加入病毒后雜交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察gfp表達(dá)情況;選取肺癌細(xì)胞系a549,細(xì)胞消化計(jì)數(shù)1000個(gè)后加入10%dmem中,加入病毒后雜交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察gfp表達(dá)情況;肺癌細(xì)胞系a549消化計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞加入1ml健康人全血中,經(jīng)過紅細(xì)胞裂解,于培養(yǎng)基中加入病毒后雜交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)表達(dá)gfp的細(xì)胞;臨床肺癌患者外周血6ml經(jīng)過紅細(xì)胞裂解、加入病毒后雜交箱中37℃孵育24h、固定及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)表達(dá)gfp的細(xì)胞;外周血經(jīng)過紅細(xì)胞裂解、病毒孵育、固定、抗cd45抗體標(biāo)記白細(xì)胞及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)表達(dá)gfp同時(shí)抗cd45(-)的細(xì)胞;肺癌患者、健康志愿者及非惡性腫瘤疾病患者外周血6ml經(jīng)過紅細(xì)胞裂解、加入病毒后37℃雜交箱中孵育24h、固定及dapi染色,熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)表達(dá)gfp的細(xì)胞,計(jì)算陽性率。結(jié)果1.在極少數(shù)健康人全血中可發(fā)現(xiàn)1~2個(gè)細(xì)胞表達(dá)gfp,但根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及大小考慮為白細(xì)胞。2.ad11-tel-gfp能夠感染人肺癌a549細(xì)胞,在細(xì)胞中大量復(fù)制并表達(dá)gfp。3.adll-tel-gfp能夠感染健康人全血中的人肺癌a549細(xì)胞,在細(xì)胞中大量復(fù)制并表達(dá)gfp,靈敏度達(dá)96%。4.ad11-tel-gfp能夠感染肺癌患者癌細(xì)胞,在癌細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)gfp,細(xì)胞大小測(cè)量均在10μm以上。同樣可發(fā)現(xiàn)少量假陽性細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞大小同樣考慮為白細(xì)胞。肺癌患者ctcs檢測(cè)熒光顯微鏡下可見癌細(xì)胞團(tuán)的存在。5.免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)記白細(xì)胞可幫助鑒定假陽性細(xì)胞,抗cd45抗體標(biāo)記示假陽性細(xì)胞為白細(xì)胞,但增加免疫細(xì)胞化學(xué)染色步驟后陽性細(xì)胞數(shù)減少。6.根據(jù)相關(guān)結(jié)果,結(jié)合膜過濾法等原理,CTCs陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn):既發(fā)出綠色熒光,又具有藍(lán)色細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,細(xì)胞最大徑大于10μm判定為陽性細(xì)胞。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn),健康人及非腫瘤肺部疾病患者血樣本可發(fā)現(xiàn)假陽性細(xì)胞,均未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞,與臨床相符。7.根據(jù)肺癌TNM分期,非小細(xì)胞肺癌患者I期陽性率為40.0%,Ⅱ期為50.0%,Ⅲ期為46.6%,Ⅳ期為77.8%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.541,P=0.136)。早期(Ⅰ~ⅢA)陽性率為43.75%,晚期(ⅢB~Ⅳ)陽性率為72.73%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.893,P=0.048)。小細(xì)胞肺癌患者局限期陽性率為20.0%,廣泛期為76.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。結(jié)論實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的端粒酶特異的復(fù)制選擇性腺病毒Ad11-Tel-GFP能夠相對(duì)特異性的識(shí)別肺癌細(xì)胞,在臨床前試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中均具有良好的效果。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是一種非常有效的檢測(cè)CTCs的方法,與臨床分期具有一定的相關(guān)性,在評(píng)估療效、預(yù)后及個(gè)體化治療等方面具有巨大的潛力。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1313063