本文關(guān)鍵詞：BENC-511對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用研究

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【摘要】：肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一。近50年來(lái)肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高,其發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第一位。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)更是具有死亡率高、發(fā)病率高、易轉(zhuǎn)移和耐藥的特點(diǎn)。非小細(xì)胞肺癌包括鱗癌(鱗狀細(xì)胞癌)、腺癌和大細(xì)胞癌,其癌細(xì)胞比小細(xì)胞癌生長(zhǎng)分裂慢、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移晚。在所有肺癌中NSCLC約占80%,大約75%的患者到了中晚期才發(fā)現(xiàn)病情,并且NSCLC的5年生存率非常低。對(duì)于肺癌的治療,目前臨床上常用的化療藥物主要是直接作用于細(xì)胞有絲分裂、DNA合成和修復(fù)等過(guò)程的傳統(tǒng)細(xì)胞毒類藥物,這些藥物選擇性低、毒性大。因此,以與腫瘤細(xì)胞分化增殖相關(guān)的信號(hào)通路的關(guān)鍵酶作為篩選靶點(diǎn),尋找選擇性作用于特定靶點(diǎn)的新型藥物已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。小分子抑制劑與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物相比,具有更好的療效和較小的毒副作用。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)是細(xì)胞生命活動(dòng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子,是脂激酶的一種,存在于體內(nèi)各種細(xì)胞中。PI3K通過(guò)募集并激活下游靶物質(zhì),以啟動(dòng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、分化、調(diào)亡、轉(zhuǎn)移、代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),以該通路中關(guān)鍵酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研究,目前已經(jīng)成為腫瘤預(yù)防和靶向治療的熱點(diǎn)。化合物S14161結(jié)構(gòu)為8-乙氧基-2-(4-氟苯基)-3-硝基-2氫-苯并吡喃,是一種作用確切的PI3K抑制劑,然而由于S14161的手性結(jié)構(gòu)和較差的溶解性能抑制了其更進(jìn)一步的應(yīng)用。我院藥物化學(xué)研究所劉兆鵬教授為獲得活性更優(yōu)的化合物,通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了S14161的類似物BENC-511,其結(jié)構(gòu)為6-溴-8-乙氧基-3-硝基-2氫-苯并吡喃。前期實(shí)驗(yàn)顯不BENC-511主要作用于PI3K/Akt通路,能顯著抑制腫瘤細(xì)胞中Akt的磷酸化水平及下游信號(hào)蛋白的表達(dá),具有良好的抗多發(fā)性骨髓瘤活性和較低毒性,但對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用未見(jiàn)報(bào)道。本課題主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),以S14161為陽(yáng)性對(duì)照藥,研究化合物BENC-511對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的作用,并在進(jìn)一步確證化合物抑制A549腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的基礎(chǔ)上,探討其作用機(jī)制。采用MTT法及克隆形成試驗(yàn)觀察BENC-511對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響；用倒置顯微鏡觀察BENC-511處理后A549細(xì)胞形態(tài)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)BENC-511對(duì)A549細(xì)胞周期DNA含量的影響,Western blot檢測(cè)BENC-511對(duì)Cyclin A1、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p21、Caspase-3、Caspase-9和P-Akt等蛋白表達(dá)水平；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BENC-511對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響；JC-1檢測(cè)BENC-511處理后A549細(xì)胞線粒體膜電位的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用不同濃度的BENC-511處理A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,細(xì)胞活力的下降呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性,克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT結(jié)果一致,處理48 h后對(duì)A549細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果顯示經(jīng)1.25、2.5、5μmol/L BENC-511作用的A549細(xì)胞形態(tài)變化顯著,細(xì)胞密度明顯減少,細(xì)胞逐漸皺縮、變圓,出現(xiàn)凋亡小體,呈濃度依賴性,10μmol/L BENC-511處理的A549細(xì)胞出現(xiàn)凋亡晚期現(xiàn)象：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,經(jīng)BENC-511作用后,A549細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例明顯增多,BENC-511將細(xì)胞周期阻滯于S期；Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞隨劑量的增加而增加,與S14161相比,10 μmol/L BENC-511誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用更明顯。Western blot結(jié)果顯示,BENC-511可下調(diào)A549細(xì)胞Cyclin Al和PCNA的表達(dá),上調(diào)p21蛋白表達(dá),上調(diào)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá),下調(diào)P-Akt表達(dá),JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化,發(fā)現(xiàn)BENC-511可使A549細(xì)胞線粒體膜電位下降,JC-1逐漸從紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變。由上可知,BENC-511可以明顯抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡,可能是與影響周期蛋白表達(dá)和降低細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān),詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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7 張峰,姜翠琴

本文編號(hào)：1306268