本文關(guān)鍵詞：BENC-511對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的作用研究

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【摘要】：肺癌是嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一。近50年來肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高,其發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第一位。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)更是具有死亡率高、發(fā)病率高、易轉(zhuǎn)移和耐藥的特點。非小細胞肺癌包括鱗癌(鱗狀細胞癌)、腺癌和大細胞癌,其癌細胞比小細胞癌生長分裂慢、擴散轉(zhuǎn)移晚。在所有肺癌中NSCLC約占80%,大約75%的患者到了中晚期才發(fā)現(xiàn)病情,并且NSCLC的5年生存率非常低。對于肺癌的治療,目前臨床上常用的化療藥物主要是直接作用于細胞有絲分裂、DNA合成和修復(fù)等過程的傳統(tǒng)細胞毒類藥物,這些藥物選擇性低、毒性大。因此,以與腫瘤細胞分化增殖相關(guān)的信號通路的關(guān)鍵酶作為篩選靶點,尋找選擇性作用于特定靶點的新型藥物已成為當今抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。小分子抑制劑與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物相比,具有更好的療效和較小的毒副作用。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)是細胞生命活動中的關(guān)鍵信號分子,是脂激酶的一種,存在于體內(nèi)各種細胞中。PI3K通過募集并激活下游靶物質(zhì),以啟動一系列信號級聯(lián)反應(yīng),在細胞生長、增殖、存活、分化、調(diào)亡、轉(zhuǎn)移、代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種細胞生物學過程中發(fā)揮重要作用。研究表明PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),以該通路中關(guān)鍵酶為靶點的抗腫瘤藥物研究,目前已經(jīng)成為腫瘤預(yù)防和靶向治療的熱點。化合物S14161結(jié)構(gòu)為8-乙氧基-2-(4-氟苯基)-3-硝基-2氫-苯并吡喃,是一種作用確切的PI3K抑制劑,然而由于S14161的手性結(jié)構(gòu)和較差的溶解性能抑制了其更進一步的應(yīng)用。我院藥物化學研究所劉兆鵬教授為獲得活性更優(yōu)的化合物,通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了S14161的類似物BENC-511,其結(jié)構(gòu)為6-溴-8-乙氧基-3-硝基-2氫-苯并吡喃。前期實驗顯不BENC-511主要作用于PI3K/Akt通路,能顯著抑制腫瘤細胞中Akt的磷酸化水平及下游信號蛋白的表達,具有良好的抗多發(fā)性骨髓瘤活性和較低毒性,但對人肺腺癌A549細胞的作用未見報道。本課題主要通過體外實驗,以S14161為陽性對照藥,研究化合物BENC-511對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的作用,并在進一步確證化合物抑制A549腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的基礎(chǔ)上,探討其作用機制。采用MTT法及克隆形成試驗觀察BENC-511對人肺腺癌A549細胞增殖的影響；用倒置顯微鏡觀察BENC-511處理后A549細胞形態(tài)的變化；流式細胞儀檢測BENC-511對A549細胞周期DNA含量的影響,Western blot檢測BENC-511對Cyclin A1、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p21、Caspase-3、Caspase-9和P-Akt等蛋白表達水平；Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)檢測BENC-511對A549細胞凋亡的影響；JC-1檢測BENC-511處理后A549細胞線粒體膜電位的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用不同濃度的BENC-511處理A549細胞24 h、48 h、72 h后,細胞活力的下降呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,克隆形成實驗結(jié)果與MTT結(jié)果一致,處理48 h后對A549細胞的抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性；倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),結(jié)果顯示經(jīng)1.25、2.5、5μmol/L BENC-511作用的A549細胞形態(tài)變化顯著,細胞密度明顯減少,細胞逐漸皺縮、變圓,出現(xiàn)凋亡小體,呈濃度依賴性,10μmol/L BENC-511處理的A549細胞出現(xiàn)凋亡晚期現(xiàn)象：流式細胞儀結(jié)果顯示,經(jīng)BENC-511作用后,A549細胞S期細胞所占比例明顯增多,BENC-511將細胞周期阻滯于S期；Annexin V陽性細胞隨劑量的增加而增加,與S14161相比,10 μmol/L BENC-511誘導(dǎo)A549細胞凋亡作用更明顯。Western blot結(jié)果顯示,BENC-511可下調(diào)A549細胞Cyclin Al和PCNA的表達,上調(diào)p21蛋白表達,上調(diào)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達,下調(diào)P-Akt表達,JC-1檢測細胞線粒體膜電位的變化,發(fā)現(xiàn)BENC-511可使A549細胞線粒體膜電位下降,JC-1逐漸從紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變。由上可知,BENC-511可以明顯抑制人肺腺癌A549細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡,可能是與影響周期蛋白表達和降低細胞線粒體膜電位有關(guān),詳細機制還需要進一步研究。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1306268