本文關(guān)鍵詞：EGFR家族中等親和力嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的廣譜抗腫瘤效能

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【摘要】：嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細(xì)胞(CART)和T細(xì)胞受體(TCR)修飾的T細(xì)胞免疫治療是新型快速發(fā)展的免疫治療策略。CAR賦予了T細(xì)胞抗原特異性的識別,激活和增殖,依賴于主要組織相容性復(fù)合物非依賴的途徑。CAR目前發(fā)展為第三代,包含兩個(gè)共刺激分子,CD28+CD134(OX40)或CD28+CD137(4-1BB),第三代CAR相比于第二代CAR,細(xì)胞因子分泌和裂解作用均增強(qiáng),激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率降低。2012年,Kloss CC研究小組在《Nature Biotechnology》上發(fā)表的關(guān)于調(diào)整親和力后雙載體系統(tǒng)(CAR+CCR)的殺傷特異性及效能,該研究在提高雙CAR系統(tǒng)的特異性的同時(shí),也開啟了調(diào)控CAR載體對抗原親和力的新的優(yōu)化方向。2015年9月《Cancer Research》上發(fā)表的兩篇調(diào)整CAR載體對抗原的親和力降低脫靶效應(yīng)的研究,研究表明高親和力的CAR-T細(xì)胞對EGFR抗原低水平的和高水平表達(dá)的腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷效能,而低親和力的CAR-T細(xì)胞只殺傷EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞,且殺傷效能與EGFR的表達(dá)量呈正相關(guān),因此,本課題我們選取中等親和力的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行研究,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)降低脫靶效應(yīng)。調(diào)整CAR-T細(xì)胞的親和力使其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,豁免低水平表達(dá)靶抗原的正常細(xì)胞,降低脫靶效應(yīng)。但由于腫瘤組織的異質(zhì)性,即腫瘤組織由于特殊的組織病理學(xué)的差異,靶抗原的表達(dá)量也會有所差異,降低CAR載體的親和力,也會引起靶抗原低水平表達(dá)的腫瘤細(xì)胞逃逸,豁免正常細(xì)胞的同時(shí)也會降低療效。因此,降低親和力,靶向單個(gè)抗原分子的CAR-T細(xì)胞無法徹底消除所有的腫瘤細(xì)胞。EGFR家族EGFR(HER1/erbB-1),HER2(ErbB-2 or neu),HER-3(erbB-3)and HER-4(erbB-4)在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、頭頸部的癌癥等多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá),且家族成員在各種惡性腫瘤組織中的總陽性比例接近100%�；谏厦娴膬蓚�(gè)原因,我們構(gòu)建了能同時(shí)靶向EGFR家族的中等親和力G3Herin-CAR-T細(xì)胞,猜想并證明其靶向識別并殺傷多種惡性腫瘤細(xì)胞,且中等親和力可以降低脫靶效應(yīng)引起對正常組織的殺傷作用。第一部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受體的構(gòu)建選取靶向EGFR家族的中等親和力HERIN片段并構(gòu)建第三代CAR載體G3Herin-CAR,通過酶切鑒定及基因測序,證明我們成功構(gòu)建了G3Herin-CAR載體。第二部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受體對T細(xì)胞株的遺傳修飾采用電穿孔技術(shù)把G3Herin-CAR載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入健康志愿者的外周血PBMC中,用2%AIM+IL-2對T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。通過蛋白免疫印跡分析,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CAR-T轉(zhuǎn)染的陽性率和激活表型的表達(dá),驗(yàn)證通過電轉(zhuǎn)染技術(shù)成功對T細(xì)胞株進(jìn)行遺傳修飾,并在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)G3Herin-CAR目的基因。第三部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的體外效能檢測本部分實(shí)驗(yàn),采用蛋白免疫印跡分析、流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFR家族蛋白的表達(dá)篩選合適的腫瘤細(xì)胞,用Recombinant human EGFR抗原刺激G3Herin-CAR-T細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子IFN-r,TNF-a的分泌量,利用xCELLigence RTCA DP儀器實(shí)時(shí)檢測CAR-T細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞的殺傷效果,評估G3Herin-CAR-T細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性效能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了最初的設(shè)計(jì):靶向EGFR家族的中等親和力pNBS328-G3Herin-CAR-T細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞具有廣譜的抗腫瘤效能,降低“脫靶效應(yīng)”的同時(shí)保證了療效。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51

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本文編號：1301862