本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默GTPBP4基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：目的:根據(jù)GTPBP4基因序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)GTPBP4-si RNA,研究GTPBP4-si RNA對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的GTPBP4基因RNA干擾慢病毒載體LV-GTPBP4-RNAi及陰性病毒載體CON053,RNAi序列為GCGTAGTCTTGGTGTTGACAT;培養(yǎng)RKO細(xì)胞,待細(xì)胞生長狀態(tài)良好并達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí),于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板,設(shè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入慢病毒LV-GTPBP4-RNAi 5ul,滴度為2×108 TU/ml,陰性對(duì)照組加入陰性病毒載體CON053 5ul,滴度為2×108 TU/ml。慢病毒感染RKO細(xì)胞3天后,因慢病毒上攜帶報(bào)告基因GFP,故GFP的表達(dá)情況,判斷感染效率,待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板時(shí)收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(1)判斷靶點(diǎn)的干擾效果可用Real-time PCR法檢測(cè)GTPBP4基因m RNA的表達(dá)情況:慢病毒感染5天后,立即抽提實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的RKO細(xì)胞的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,并經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt分析法分析Real-time PCR數(shù)值。(2)用western blot法檢測(cè)GTPBP4蛋白質(zhì)的表達(dá)情況:慢病毒感染5天后,提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組RKO細(xì)胞的總蛋白,以BCA法來測(cè)定蛋白濃度,以GAPDH蛋白為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳,免疫印跡(濕轉(zhuǎn)),抗體雜交,X光顯影分析結(jié)果。(3)感染5天后,用Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)各組RKO細(xì)胞凋亡率。(4)用MTT法于分板后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組RKO細(xì)胞的增殖情況。(5)用PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)來檢測(cè)GTPBP4基因與RKO細(xì)胞周期分布的相關(guān)性。(6)通過感染后細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示慢病毒感染后細(xì)胞的成瘤能力。結(jié)果:(1)用熒光顯微鏡在慢病毒感染3天后觀察,根據(jù)發(fā)綠色熒光的RKO細(xì)胞所占比率判斷慢病毒感染RKO細(xì)胞的效率達(dá)80%以上。(2)Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果:數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法,實(shí)驗(yàn)組2-ΔΔCt平均值為0.208,對(duì)照組的2-ΔΔCt平均值為1.002,顯示實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞中GTPBP4的m RNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(p0.05)。(3)western blot結(jié)果:X光顯影后,可見各組內(nèi)對(duì)照GAPDH蛋白灰度相似,而實(shí)驗(yàn)組GTPBP4蛋白灰度值明顯低于對(duì)照組,顯示si RNA對(duì)目的基因的表達(dá)有敲減作用,根據(jù)灰度分析結(jié)果,敲減效率達(dá)到72.9%。(4)凋亡檢測(cè)顯示:慢病毒感染后,對(duì)于凋亡峰值實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞明顯高于對(duì)照組,且峰值出現(xiàn)時(shí)間早于對(duì)照組,表明實(shí)驗(yàn)組RKO凋亡細(xì)胞增加。(5)MTT法檢測(cè)結(jié)果:在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組OD值均值分別為1.00、1.54、2.61、4.15、8.09,實(shí)驗(yàn)組分別為1.00、1.49、2.23、3.12、6.33,顯示慢病毒感染后,實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞MTT值比值(即增殖倍數(shù))減小,提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的增殖能力顯著相關(guān)。(6)PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果:慢病毒感染后,處于G1期及G2/M期的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞顯著增多,而處于S期的明顯減少,提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的周期分布相關(guān)。(7)細(xì)胞克隆形成檢測(cè)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)目平均值為63,對(duì)照組為106,顯示慢病毒感染后,實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞集落數(shù)目與對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)目相比減少,提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的克隆形成能力相關(guān)。結(jié)論:1.慢病毒介導(dǎo)的RNAi能高效感染RKO細(xì)胞,并有效抑制RKO細(xì)胞中相應(yīng)基因的表達(dá)。2.沉默GTPBP4基因能抑制RKO細(xì)胞克隆形成能力及增殖能力,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯。3.GTPBP4可能是結(jié)腸癌新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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