本文關(guān)鍵詞：PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

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【摘要】：研究背景乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤,是世界上嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。現(xiàn)在全球乳腺癌的發(fā)病率逐年上升,近年來(lái)中國(guó)大部分的城市調(diào)查顯示乳腺癌的發(fā)病率和死亡率居前二位,有逐年上升的趨勢(shì),成為人口疾病中死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥,而且乳腺癌的發(fā)病年齡出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì),隨著年齡增大發(fā)病率也增加。因此防治乳腺癌具有重要的意義。乳腺癌按其浸潤(rùn)程度可分為原位癌、浸潤(rùn)性癌,以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌多見(jiàn)。目前乳腺癌發(fā)病的機(jī)制尚未完全清楚,但是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,是癌基因和抑癌基因參與的多因素、多階段及多步驟的過(guò)程。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與多種腫瘤相關(guān)因子及其功能改變密切相關(guān)。腫瘤的發(fā)生是在某些復(fù)雜因素作用下,細(xì)胞在基因水平表達(dá)出現(xiàn)異常,復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯,無(wú)論哪個(gè)環(huán)節(jié)均可出現(xiàn)調(diào)控失常,最終使細(xì)胞產(chǎn)生異常增殖。當(dāng)機(jī)體免疫功能絮亂,免疫因子發(fā)生異常的情況下也可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。惡性腫瘤在機(jī)體內(nèi)具有其復(fù)雜而又異質(zhì)性的微環(huán)境,以至于只有某些特定的分子可以進(jìn)入血管或者淋巴管,讓腫瘤細(xì)胞能順利逃逸機(jī)體的免疫攻擊,得以優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)甚至轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在著許多因素使機(jī)體的免疫狀態(tài)受到抑制,這些抑制性因素主要分為：T細(xì)胞功能障礙；腫瘤細(xì)胞表面抑制性配體,如PD-Ll.B7x:抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞；抑制性細(xì)胞因子,如TGF-β;腫瘤弱抗原性及凋亡因子等。有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)局部微環(huán)境變化,在病灶內(nèi)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少及免疫功能減弱。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞,是識(shí)別外源性抗原及發(fā)生有效免疫應(yīng)答的關(guān)鍵、是抗腫瘤免疫的基礎(chǔ)。在免疫系統(tǒng)中,T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞(APC)以及T細(xì)胞受體(TCR)與多種協(xié)同刺激分子受體的關(guān)系是極其復(fù)雜的,協(xié)同刺激分子既可激活T細(xì)胞,也可傳遞負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)抑制T細(xì)胞的活化。T細(xì)胞的活化以及抑制信號(hào)的相互作用在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別內(nèi)源性及外源性抗原發(fā)揮特別重要作用,從而防止自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用主要表現(xiàn)為T細(xì)胞的活化與增殖,免疫應(yīng)答初期,TCR識(shí)別并結(jié)合由APC上抗原肽-MHC分子復(fù)合物,接著由抗原提呈細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子提供刺激信號(hào),這樣T細(xì)胞才能產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。免疫應(yīng)答過(guò)程中的雙重信號(hào)是必須同時(shí)存在才能完成的,如果免疫應(yīng)答過(guò)程中出現(xiàn)協(xié)同刺激分子減少,僅有第一信號(hào)將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞活化受抑制或者是特異性免疫耐受,T細(xì)胞進(jìn)入失去功能的無(wú)應(yīng)答狀態(tài),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并失去抵抗腫瘤的免疫能力。根據(jù)協(xié)同刺激分子的功能各異可將其分為正性協(xié)同刺激分子和負(fù)性協(xié)同刺激分子。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)B7家族的新成員程序性死亡配體-1(PD-L1)是典型的負(fù)性協(xié)同刺激分子,是目前免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱門對(duì)象之一。PD-1稱程序性死亡-1,是CD28/CTLA-4家族成員之一,其配體是B7家族成員PD-L1和PD-L2。 PD-1通常與其配體共同組成信號(hào)通路,并能傳導(dǎo)抑制性信號(hào)給T細(xì)胞從而阻斷正常免疫應(yīng)答的發(fā)生。PD-1是由288個(gè)氨基酸組成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,由胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、胞漿區(qū)共同組成。其胞外區(qū)由一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域、4個(gè)重要的N連接糖基化位點(diǎn)構(gòu)成,該結(jié)構(gòu)可能在與配體的結(jié)合中發(fā)揮重要的作用。胞漿區(qū)含兩個(gè)酪氨酸殘基,形成免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM),而免疫受體酪氨酸抑制基序可通過(guò)酪氨酸的磷酸化作用拮抗抗原受體刺激信號(hào)的功能,因此在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。PD-1表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞上。正常狀態(tài)下T、B細(xì)胞不表達(dá)PD-1,但是在激活情況下其表達(dá)上調(diào)。PD-1的兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2均屬B7家族成員。PD-1/PD-L1介導(dǎo)的負(fù)性刺激信號(hào)途徑能夠抑制T細(xì)胞的功能,在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用,并且對(duì)自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫及慢性病毒感染等都有重要的意義。大量研究表明PD-L1在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的調(diào)解作用具有雙重性。首先,PD-L1能刺激初始的T細(xì)胞增殖、分化；另外,其可抑制活化的T細(xì)胞增殖、分化,甚至促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞生物功能受到顯著抑制。生理狀態(tài)下,組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等表面表達(dá)PD-L1,它與活化T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合,抑制T細(xì)胞進(jìn)一步增殖、活化,使機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)維持在一定水平,處于動(dòng)態(tài)平衡。而PD-L1對(duì)T細(xì)胞不同的作用還會(huì)受到TCR和CD28信號(hào)的強(qiáng)弱的影響,在低于適量TCR信號(hào)刺激時(shí),PD-L1對(duì)T細(xì)胞的增殖明顯抑制；在沒(méi)有CD28協(xié)同刺激信號(hào)時(shí)給予最適量TCR信號(hào),此時(shí)是促進(jìn)T細(xì)胞增殖的作用。有研究表明,PD-L1能與受體PD-1結(jié)合后能顯著降低IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。而CD4+T細(xì)胞可自分泌IL-2,而大量的IL-2能與PD-1/PD-L1途徑產(chǎn)生的抑制作用相拮抗。對(duì)于CD8+T細(xì)胞自分泌的IL-2較少但分泌大量IFN-y,因此,PD-1/PD-L1途徑對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用更加明顯�？傊�,PD-1/PD-L1抑制途徑對(duì)活化的CD8+T細(xì)胞的進(jìn)一步增殖和活化有顯著的抑制作用,腫瘤細(xì)胞能借助此途徑逃逸CTL的殺傷作用,從而減弱機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答.PD-1/PD-L1途徑產(chǎn)生的抑制效應(yīng)可以被CD28信號(hào)或IL-2所逆轉(zhuǎn)。應(yīng)用阻斷型抗PD-L1單抗阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)能夠通過(guò)上調(diào)IL-2 IFN-y的分泌而有效逆轉(zhuǎn)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖受抑,同時(shí)明顯增強(qiáng)T細(xì)胞的活化程度和殺傷能力。Dong等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)帶有PD-L1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外試驗(yàn)中可抵抗CTL裂解,腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1與活化的腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合,能促進(jìn)該T細(xì)胞的凋亡,小鼠接種后其致瘤性和侵襲性更加強(qiáng)。而通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)相互作用則可逆轉(zhuǎn)該信號(hào)通路的抑制效應(yīng),增強(qiáng)CTL的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有研究證實(shí)在負(fù)荷黑色素瘤細(xì)胞的小鼠上接種阻斷性抗PD-L1單抗能阻斷PD-1/PD-L1途徑在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用,能有效延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。目前乳腺癌的治療手段從原來(lái)單一的手術(shù)治療發(fā)展為現(xiàn)在的包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療及生物學(xué)治療的綜合性治療。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)研究的出現(xiàn),不斷深入探索使分子免疫學(xué)領(lǐng)域的知識(shí)得以在乳腺癌治療中應(yīng)用,越來(lái)越多的免疫學(xué)分子指標(biāo)成為了乳腺癌研究的熱點(diǎn)。如近年來(lái),ER、PR、HER-2已成為乳腺癌患者免疫組織化學(xué)常規(guī)檢查的標(biāo)志性項(xiàng)目。盡管乳腺癌被認(rèn)為是免疫原性不如黑色素瘤或腎細(xì)胞癌,但越來(lái)越多的證據(jù)表明乳腺癌與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。有研究揭示了在外周血以及乳腺癌患者的腫瘤中存在免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織內(nèi),PD-L1和CD28分子家族的抑制性受體在腫瘤免疫特異性T細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)。綜上所述,PD-L1參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,并協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷作用,使腫瘤可以進(jìn)一步惡化。對(duì)于乳腺癌與PD-L1表達(dá)上調(diào)是否有關(guān)系,需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確。目的探討PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)情況,以及其與患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的相關(guān)性。為乳腺癌的治療以及預(yù)后提供臨床參考價(jià)值。方法1.提取乳腺癌細(xì)胞株mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,并以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中PD-L1基因的表達(dá)；2.用Western Blot (蛋白質(zhì)印跡)法檢測(cè)10對(duì)乳腺癌及癌旁組織的PD-L1蛋白的表達(dá)量;3.購(gòu)乳腺癌組織芯片,用免疫組化的方法檢測(cè)乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá),分析其與患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系；4.資料數(shù)據(jù)采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)采用單向方差分析、多重比較采用LSD法檢驗(yàn)；蛋白印跡檢測(cè)PD-L1蛋白,兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行分析,生存率比較用Log-rank檢驗(yàn)。多元回歸分析采用COX回歸模型進(jìn)行分析。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1. qRT-PCR結(jié)果顯示,乳腺癌細(xì)胞株中ZR-75-1 (2.7±0.46)、BT-20 (3.8±0.35)、 MDA-MB-231 (5.23q0.35)以及BT-549(4.0±0.56)具有較高的PD-L1表達(dá),而在MCF-7、SKBr-3、T47D及BT-474細(xì)胞株中表達(dá)較低。2.為了驗(yàn)證PD-L1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá),我們收集了10對(duì)乳腺癌及癌旁的組織。通過(guò)Western Blot檢驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)10對(duì)組織中,乳腺癌中的PD-L1均較癌旁組織表達(dá)高。應(yīng)用ImageJ軟件分析計(jì)算蛋白條帶灰度值,經(jīng)兩樣本配對(duì)T檢驗(yàn)顯示乳腺癌組織中PD-L1蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P0.05)。3.PD-L1在乳腺癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率為22.7%,PD-L1表達(dá)與乳腺癌患者T分期、N分期、ER受體、PR受體相關(guān)(P0.05)�；颊咧蠵D-L1陽(yáng)性的其T、N分期高,且以ER、PR受體陰性為主。PD-L1陽(yáng)性的患者生存時(shí)間明顯縮短(P=0.000)。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示PD-L1是影響乳腺癌患者生存及預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.038)。結(jié)論1.乳腺癌癌組織檢測(cè)到PD-L1表達(dá),并且其PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。2.PD-L1表達(dá)與乳腺癌患者T分期、N分期呈正相關(guān),而與PR受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。3.患者ER受體、PR受體及PD-L1的表達(dá)與預(yù)后顯著相關(guān),PD-L1陽(yáng)性的患者生存時(shí)間明顯縮短(P=0.000)。4.PD-L1是影響乳腺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1298950