發(fā)布時(shí)間：2017-12-16 16:02

  本文關(guān)鍵詞：TIMELESS在宮頸癌中的異常表達(dá)及靶向治療的研究

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【摘要】：目的:探索TIMELESS在宮頸癌中的表達(dá)及其功能,靶向TIMELESS對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、克隆、順鉑敏感性的影響。方法:生物信息學(xué)分析TIMELESS在三個(gè)獨(dú)立的宮頸癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá);通過(guò)對(duì)子宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)和宮頸癌組織進(jìn)行免疫組化研究,分別檢測(cè)TIMELESS在CIN I、CIN II、CIN III和宮頸癌組織中的表達(dá);利用宮頸癌組織芯片進(jìn)行免疫組化分析,研究TIMELESS在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率;用Western Blot技術(shù)分析人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A細(xì)胞中TIMELESS的表達(dá),篩選高表達(dá)細(xì)胞株;設(shè)計(jì)合成三組針對(duì)人TIMELESS基因的小干擾RNA(siRNA),并通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞株體內(nèi),應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組(TIMELESS siRNA#1組、siRNA#2組和siRNA#3組)及陰性對(duì)照siRNA(Ctrl siRNA組)TIMELESS mRNA和蛋白的表達(dá);CCK8法檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖能力以及對(duì)順鉑敏感性的變化;通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組在凋亡中的差異;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的克隆形成能力;細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TIMELESS siRNA并聯(lián)合順鉑處理,β-半乳糖苷酶法檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老;通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved caspase-3各組細(xì)胞的表達(dá);通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)TIMELESS敲除后各組細(xì)胞γ-H2AX及Rad51蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示TIMELESS在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織(P0.05),提示TIMELESS可能在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用;2.TIMELESS在從CIN I、CIN II、CIN III到宮頸癌的進(jìn)展過(guò)程中陽(yáng)性表達(dá)水平逐漸升高,呈明顯遞增趨勢(shì)(P0.05);3.對(duì)宮頸癌的組織芯片進(jìn)行TIMELESS免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)TIMELESS在宮頸癌中有52.5%(21/40例)呈陽(yáng)性表達(dá);4.宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、Caski、C33A細(xì)胞中TIMELESS蛋白表達(dá)水平中,SiHa細(xì)胞中TIMELESS蛋白表達(dá)較高;5.靶向TIMELESS的三對(duì)特異性siRNA:siRNA#1,si RNA#2,siRNA#3均可明顯抑制TIMELESS的表達(dá),在SiHa細(xì)胞中,相對(duì)Ctrl siRNA組,RTPCR結(jié)果顯示siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3組中TIMELESS的mRNA表達(dá)量分別為(0.263±0.018)、(0.157±0.013)、(0.286±0.021),Western Blot結(jié)果顯示siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3組中TIMELESS蛋白表達(dá)量分別為(0.162±0.052)、(0.134±0.057),(0.173±0.062)(P0.01)。siRNA#1和siRNA#2的效果較好。6.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示siRNA#1組與siRNA#2組細(xì)胞的增殖能力顯著下降;7.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組siRNA#1組與siRNA#2組的細(xì)胞早期凋亡明顯增加;8.在Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中,SiHa細(xì)胞克隆數(shù)為(209.333±3.383),(111±3.786),(129.667±3.590);9.β-半乳糖苷酶法檢測(cè)各組細(xì)胞的衰老,順鉑作用后,顯示實(shí)驗(yàn)組的衰老細(xì)胞比率均上升(P0.0001)。10.隨著順鉑濃度的增加,Ctrl siRNA、siRNA#1、siRNA#2三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖均受到抑制,細(xì)胞半數(shù)抑制率IC50(μg/ml)分別為7.907,5.052,2.565,可見TIMELESS siRNA可以增加宮頸癌SiHa細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性;11.實(shí)驗(yàn)組中,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)有明顯的增加;12.TIMELESS敲減后,DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX表達(dá)增加,同時(shí)可以抑制SiHa細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白R(shí)ad51的表達(dá)。結(jié)論:TIMELESS在宮頸癌中異常高表達(dá),靶向敲減TIMELESS,可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖和克隆形成能力、促進(jìn)SiHa凋亡和衰老,并增強(qiáng)SiHa細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

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1 蒯玲玲;TIMELESS在宮頸癌中的異常表達(dá)及靶向治療的研究[D];蘇州大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1296598