發(fā)布時間：2017-12-12 13:08

  本文關(guān)鍵詞：FGF4誘導(dǎo)肺腺癌EMT的相關(guān)機制研究

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【摘要】：研究目的:研究FGF4在肺腺癌細胞系中誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)過程中的相關(guān)機制,闡明FGF4在動物模型和腺癌組織中的表達意義,因而為控制肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。研究方法:1.用轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)A549及H1299細胞發(fā)生EMT,檢測不同成纖維細胞生長因子受體及配體的變化。2.用成纖維細胞生長因子FGF4及FGF7分別刺激肺腺癌細胞系A(chǔ)549和H1299發(fā)生EMT過程,用Western Blotting檢測相關(guān)標志物如E-cadherin、Vimentin的表達情況;同時檢測不同時間點轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist和Slug的表達情況;通過聚合酶鏈式反應(yīng)的方法檢測FGF4與FGF7的特異性受體FGFR2 IIIb和FGFR2IIIc的基因表達情況。3.用FGF4和FGF7分別刺激A549和H1299細胞,采用鬼炳環(huán)肽標記細胞骨架蛋白F-actin、Transwell、CCK-8及軟瓊脂成瘤實驗來檢測細胞的細胞骨架,移動,侵襲,增殖以及細胞干性能力的變化。4.用Western Blotting的方法檢測在FGF4的刺激下,相關(guān)的通路變化情況。用鈣熒光探針Fluo 3-AM的方法檢測細胞內(nèi)鈣離子的變化。用Co-IP的方法檢測FGF4與鈣池操控性鈣離子通道(store-operated calcium entry,SOCE)關(guān)鍵蛋白Orai1之間的蛋白相互作用關(guān)系。5.用Western Blotting和Fluo 3-AM的方法,檢測在FGF4的刺激下,加入FGFR的抑制劑BGJ398后,細胞內(nèi)鈣離子和Orai1的表達變化。6.構(gòu)建3個Orai1的小干擾RNA,通過Western Blotting的方法篩選出沉默效率最高的一個干擾RNA,以進行后續(xù)的實驗。7.用Western Blotting和Fluo 3-AM的方法,觀察在FGF4的刺激下,通過轉(zhuǎn)染si-Orai1或加入SOCE抑制劑2,5-di-tert-butylhydroquinone(BHQ)后,EMT相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的變化,以及細胞內(nèi)鈣離子的變化情況。8.用FGF4刺激A549和H1299細胞,之后轉(zhuǎn)染si-Orai1或加入SOCE抑制劑BHQ后,采用鬼炳環(huán)肽標記細胞骨架蛋白F-actin、Transwell、CCK-8及軟瓊脂成瘤實驗來檢測細胞的細胞骨架,移動,侵襲,增殖以及細胞干性能力的變化。9.通過在裸鼠腹股溝部位皮下注射H1299細胞來檢測FGF4和SOCE抑制劑對活體動物成瘤的作用和影響,實驗分為3組,對照組、FGF4作用組(實驗組1)和FGF4/BHQ組(實驗組2)。實驗組1中,當成瘤后,在腫物部位給予每周兩次的FGF4;實驗組2中,在給予FGF4十五天后,給予每周3次的BHQ。一個月后,處死老鼠,觀察三組的腫物大小,遠處轉(zhuǎn)移情況,以及通過免疫組化的方法,檢測三組瘤組織中FGF4、Orai1、E-cadherin,Vimentin的表達。10.選取60例肺腺癌組織標本,21例配對的肺腺癌原發(fā)灶與相應(yīng)的肺轉(zhuǎn)移灶,用SPSS分析FGF4的表達與患者臨床病理特征(年齡、性別、腫物大小、部位、組織學(xué)類型、TNM分期、以及轉(zhuǎn)移)之間的關(guān)系、FGF4的表達在肺腺癌原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶之間的差異、FGF4的表達與EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin之間的關(guān)系、FGF4的表達與Orai1之間關(guān)系。研究結(jié)果:1.經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1(5ng/ml)刺激后,肺腺癌細胞系A(chǔ)549和H1299中FGFR2 IIIb表達減少,FGFR2 IIIc表達增多,并且FGFR2 IIIb的特異性配體FGF7表達下降,FGFR2 IIIc的特異性配體FGF4表達增多。2.用FGF4和FGF7刺激細胞,Western Blotting的結(jié)果顯示隨著FGF4濃度的增加,E-cadherin表達逐漸減少,Vimentin表達逐漸增加,轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist表達增加,Slug的表達并無明顯變化。而FGF7對這些蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達并無明顯作用。與TGF-β1的作用一致,在FGF4的刺激下,FGFR2 IIIc表達增高,并且FGFR2 IIIb的特異性配體FGF7表達下降,FGFR2 IIIc的特異性配體FGF4表達增多,同樣,FGF7對這一現(xiàn)象無影響。3.在FGF4的刺激下,A549和H1299細胞出現(xiàn)了細胞骨架重拍的現(xiàn)象,F-actin的表達由細胞膜移至細胞內(nèi),并且細胞呈現(xiàn)梭形、極性喪失的表現(xiàn);細胞的增殖、移動、侵襲和干性能力增加。4.通過對經(jīng)典的FGFR/FGF通路MAPK/ERK和PI3K-AKT進行檢測,發(fā)現(xiàn)FGF4并沒有激活p-AKT和p-ERK,而發(fā)現(xiàn)作為SOCE關(guān)鍵蛋白Orai1的表達升高。用鈣熒光探針Fluo 3-AM檢測細胞內(nèi)的Ca~(2+)離子濃度發(fā)現(xiàn),FGF4的刺激能夠增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca~(2+)離子內(nèi)流。Co-IP結(jié)果表明,FGF4與Orai1存在蛋白之間的相互作用關(guān)系。5.在FGF4刺激的同時,給予FGFR的抑制劑BGJ398,觀察到BGJ398能夠逆轉(zhuǎn)FGF4引起的細胞內(nèi)Ca~(2+)離子濃度增加和Orai1表達升高的現(xiàn)象。6.對構(gòu)建好的3個Orai1的小干擾RNA進行Western Blotting檢測,選出沉默效率最高的si-1進行后續(xù)的實驗。7.在FGF4的刺激下,同時對A549和H1299細胞轉(zhuǎn)染si-Orai1或加入SOCE抑制劑BHQ,觀察到FGF4的這種促EMT作用被si-Orai1或BHQ所逆轉(zhuǎn),表現(xiàn)為E-cadherin表達增加,Vimenti、Snail、Twist表達減少,同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca~(2+)離子濃度減少。8.為了檢測si-Orai1和BHQ對細胞功能學(xué)的影響,我們在給予FGF4刺激下,轉(zhuǎn)染si-Orai1或加入BHQ,發(fā)現(xiàn)這兩者能夠逆轉(zhuǎn)FGF4引起的細胞骨架重拍、降低了細胞的增殖能力,移動、侵襲和干性能力明顯減弱。9.動物實驗的結(jié)果表明,FGF4作用于裸鼠,與對照組和實驗組2相比所形成的皮下腫物體積較大,并且實驗組1出現(xiàn)了2例肺轉(zhuǎn)移,2例血管內(nèi)癌栓,3例骨骼肌浸潤。而實驗組2皮下腫物的體積與對照組相比并沒有明顯差異并且沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移。在處死裸鼠后,通過對這3組的皮下腫物進行免疫組化染色,結(jié)果表明實驗組1與對照組和實驗組2相比,出現(xiàn)Orai1表達的顯著增加。與對照組相比,實驗組1出現(xiàn)了E-cadherin表達減少而Vimentin表達增加,然而在實驗組2中,免疫組化的結(jié)果表明加入BHQ后能夠逆轉(zhuǎn)FGF4引起的這種促EMT現(xiàn)象。10.在肺腺癌組織標本中的研究表明,FGF4的表達與患者的年齡、性別、腫物大小、腫物部位并不相關(guān),而與肺腺癌患者的組織學(xué)類型(P0.05),TNM分期(P0.05)和轉(zhuǎn)移(P0.05)之間存在統(tǒng)計學(xué)意義。在配對的肺腺癌組織和對應(yīng)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中,在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中FGF4高表達(P0.05)。通過對FGF4與EMT相關(guān)蛋白的表達進行分析,FGF4的表達與Vimentin呈正相關(guān),而與E-cadherin呈負相關(guān)(P0.05)。最后,我們檢測了FGF4的表達與SOCE關(guān)鍵蛋白Orai1的表達情況,結(jié)果表明:FGF4的表達與Orai1表達呈正相關(guān)性(P0.05)。研究結(jié)論:通過在肺腺癌細胞系,動物模型以及人肺腺癌組織中的研究,我們發(fā)現(xiàn)FGF4的表達能夠促進EMT,表現(xiàn)為上皮相關(guān)蛋白的表達降低和間質(zhì)相關(guān)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子的表達增高,以及細胞骨架的重拍、移動侵襲、增殖、干性能力的增加。在FGF4的作用下,細胞內(nèi)的Ca~(2+)離子濃度增高,而抑制FGFR、加入SOCE抑制劑或降表達Orai1,能夠逆轉(zhuǎn)FGF4的促EMT作用。由此我們推斷SOCE在FGF4的促EMT過程中起著關(guān)鍵的作用。在裸鼠的體內(nèi)實驗中,FGF4的刺激能夠促進腫物的生長,使裸鼠出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶、骨骼肌浸潤和血管內(nèi)癌栓。FGF4在肺腺癌組織中的高表達意味著更高的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能,并且其表達與Vimentin和Orai1呈正相關(guān),而與E-cadherin呈負相關(guān)。綜上所述,通過在體外的細胞學(xué)實驗、體內(nèi)的動物實驗以及在肺腺癌組織標本中的研究表明,在FGF4所誘導(dǎo)的肺腺癌EMT過程中,SOCE發(fā)揮著重要的作用。針對SOCE在肺腺癌EMT過程中的研究,能夠為控制肺腺癌轉(zhuǎn)移提供一個新的理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1282594