本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍通過Shh信號通路對乳腺癌抗腫瘤作用的機(jī)制研究

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【摘要】：[研究背景及目的]二甲雙胍是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的口服降糖藥物,主要用于治療2型糖尿病。近年來一些臨床流行病學(xué)研究證實二甲雙胍可以降低2型糖尿病患者一些惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險,多項體外研究和動物實驗發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對多種類型的癌細(xì)胞均具有一定程度的抑制作用,并可抑制裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長。但是二甲雙胍抑制腫瘤的確切機(jī)制至今仍不清楚。本研究主要探討二甲雙胍對乳腺癌細(xì)胞Shh信號通路的調(diào)控作用,闡明二甲雙胍通過Shh信號通路對乳腺癌增殖、遷移、侵襲能力及乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)干性的影響；并進(jìn)一步探討腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在其中的調(diào)控作用。[方法]逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和western blot檢測二甲雙胍對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和BT549細(xì)胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1表達(dá)的影響；將MDA-MB-231細(xì)胞分為空白對照組、1μg/mL rhShh蛋白組、3mM二甲雙胍組和1μg/mL rhShh蛋白+3mM二甲雙胍組,用細(xì)胞增殖實驗、克隆形成實驗檢測對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響；劃痕實驗、matrigel侵襲實驗檢測對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)、mammosphere形成實驗檢測對BCSCs干性的改變；將表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的MDA-MB-231細(xì)胞接種于BALB/c-nu鼠的乳腺脂肪墊部位,分別給予瘤內(nèi)注射rhShh蛋白、二甲雙胍灌胃、瘤內(nèi)注射rhShh蛋白+二甲雙胍灌胃的處理,使用活體成像系統(tǒng)(IVST)檢測腫瘤體積的大小,比較不同處理組之間腫瘤的生長情況；MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒(siCtr)和AMPK小干擾RNA質(zhì)粒(siAMPK#2)后,再分別給予rhShh蛋白、二甲雙胍、rhShh蛋白十二甲雙胍的處理,用western blot檢測細(xì)胞中Gli1的表達(dá)情況,用mammosphere形成實驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測對BCSCs的影響。[結(jié)果]1.二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1的表達(dá),且呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性。2.二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖。用MTT實驗和克隆形成實驗檢測rhShh蛋白、二甲雙胍以及rhShh蛋白和二甲雙胍的聯(lián)合處理對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響。MTT實驗顯示rhShh蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖；二甲雙胍顯著抑制細(xì)胞的生長,同時二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(**或##P0.01)�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示同空白對照組相比,二甲雙胍抑制乳腺癌細(xì)胞形成的克隆的數(shù)目和大小,此外,二甲雙胍也抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)的克隆的數(shù)目和大小(**或##0.01)。3.裸鼠移植瘤模型中二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的腫瘤生長。分析熒光數(shù)據(jù)表明rhShh蛋白處理組的腫瘤體積顯著大于空白對照組腫瘤的體積；二甲雙胍抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)的腫瘤生長(**或##0.01)。免疫組化實驗結(jié)果顯示rhShh蛋白組的Gli1表達(dá)水平較高,聯(lián)合處理組的Gli1水平比rhShh蛋白組的低。4.二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲。劃痕實驗顯示rhShh蛋白處理組的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；與之相反的是,二甲雙胍抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力；聯(lián)合處理組顯示二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力(**或#粕0.01)。Matrigel侵襲實驗顯示rhShh蛋白處理的細(xì)胞穿過matrigel膠和小室膜的數(shù)量約是空白對照組的三倍；同rhShh蛋白處理組相比,rhShh蛋白聯(lián)合二甲雙胍的處理顯著抑制了細(xì)胞的侵襲能力(**或##JP0.01)。5.二甲雙胍抑制rhShh蛋白誘導(dǎo)的BCSCs干性增強(qiáng)。Mammosphere形成實驗表明同空白對照組相比,rhShh蛋白作用的MDA-MB-231細(xì)胞形成的球體數(shù)目更多、體積更大；而二甲雙胍抑制了MDA-MB-231細(xì)胞形成的球體的數(shù)目和體積,也抑制了rhShh蛋白誘導(dǎo)形成數(shù)目更多和體積更大的球體(**或##0.01)。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞中CD44+/CD24-/low細(xì)胞的比例,rhShh蛋白誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞中CD44+/CD24-/low細(xì)胞的比例提高；二甲雙胍的作用降低細(xì)胞中的CD44+/CD24-/low細(xì)胞比例；聯(lián)合處理組顯示二甲雙胍顯著抑制了由rhShh蛋白誘導(dǎo)的CD44+/CD24-/low細(xì)胞比例的提高(**或##0.01)。6. Western blot顯示同空白對照及轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA后,又進(jìn)行rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的MDA-MB-231細(xì)胞中Gli1的表達(dá)水平相比,轉(zhuǎn)染AMPKαl siRNA#2后又進(jìn)行rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的MDA-MB-231細(xì)胞中Gli1的表達(dá)水平明顯升高。7.在rhShh蛋白和二甲雙胍聯(lián)合處理的情況下,同空白對照及轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞形成的微球體相比,轉(zhuǎn)染AMPKal siRNA#2的MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生的微球體數(shù)目更多、體積更大(P0.01),而且其中的CD44+/CD24-/low干細(xì)胞的比例顯著升高(P0.01)。[結(jié)論]本實驗結(jié)果表明二甲雙胍通過抑制乳腺癌細(xì)胞中的Shh信號通路發(fā)揮抗癌作用。二甲雙胍導(dǎo)致的Shh信號通路的下調(diào)抑制了體外實驗中的乳腺癌細(xì)胞的增殖、減弱了細(xì)胞的遷移和侵襲能力、降低了乳腺癌干細(xì)胞的比例和自我更新能力,并且抑制了裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長。二甲雙胍對Shh信號通路的抑制是依賴AMPK調(diào)控的。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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