本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞在結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞5-FU耐藥中的作用及機(jī)制

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【摘要】：結(jié)腸癌是臨床發(fā)病率和死亡率常年高居第三的常見(jiàn)腫瘤,對(duì)全人類的健康狀態(tài)構(gòu)成了極大的威脅和影響[1]。雖然新的治療技術(shù)及新的靶向藥物的不斷研發(fā),在一定程度上改善了結(jié)腸癌病人的預(yù)后,但以5-FU為基礎(chǔ)的化療,仍然是臨床上結(jié)腸癌病人化療的一線選擇。但有超過(guò)一半的5-FU用藥患者由于持續(xù)使用5-FU化療后,對(duì)5-FU敏感性降低而對(duì)5-FU產(chǎn)生了化療耐藥[2,3,4]。因此,闡明5-FU的耐藥機(jī)制對(duì)提高5-FU化療療效、改善結(jié)腸癌患者預(yù)后極為重要。新近研究表明臨床上許多化療所用的治療藥物實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤療效是由于激活了腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,使其發(fā)生凋亡[5]。所以腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的抑制及阻斷已成為化療抵抗的原因之一。我們前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了5-FU是通過(guò)激活其P-JNK依賴的Caspase-3的凋亡信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌CT26細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用[6]。目前,大量研究已證實(shí)腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等方面都發(fā)揮著重要的作用[7,8,9]。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要細(xì)胞成分,已有研究證實(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的癌變、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞的侵襲外滲及腫瘤組織中的血管新生等多個(gè)方面均有至關(guān)重要的影響和作用[10,11],但其與化療耐藥的關(guān)系研究善少。我們前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)5-FU可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞多胺合成增加,多胺進(jìn)一步可通過(guò)抑制了由5-FU激活的P-JNK/caspase-3凋亡信號(hào)通路從而引起結(jié)腸癌對(duì)5-FU產(chǎn)生化療抵抗[6]。我們的研究以巨噬細(xì)胞多胺代謝異常為切入點(diǎn),解析巨噬細(xì)胞在結(jié)腸癌5-FU耐藥中的作用及機(jī)制,研究結(jié)果對(duì)于從腫瘤微環(huán)境角度尋找提高腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,改善5-FU的抗癌療效,提高患者生存率的有效策略都有重要的指導(dǎo)意義。目的:探討巨噬細(xì)胞在結(jié)腸癌CT26細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生耐藥過(guò)程中的作用及機(jī)制。方法:1.5-FU可通過(guò)激活結(jié)腸癌CT26細(xì)胞P-JNK/caspase-3凋亡信號(hào)通路以發(fā)揮其抗癌效應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡在5-FU發(fā)揮抗癌效應(yīng)中的作用,我們運(yùn)用細(xì)胞凋亡檢測(cè)及western blot等方法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞用或不用5-FU處理下的細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk的表達(dá)。進(jìn)一步建立結(jié)腸癌ct26細(xì)胞小鼠移植瘤模型,運(yùn)用p-jnk特異性抑制劑抑制p-jnk/caspase-3凋亡信號(hào)通路后,再觀察5-fu療效,驗(yàn)證該凋亡通路在5-fu發(fā)揮抗癌效應(yīng)中的作用。2.5-fu可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞引起結(jié)腸癌ct26細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生耐藥。為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞在結(jié)腸癌ct26細(xì)胞5-fu化療耐藥中的作用,我們分別用正常培養(yǎng)基(nm)、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清(cm)及預(yù)先用低劑量5fu處理過(guò)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清(cm(5-fu))處理ct-26細(xì)胞,并給予5-fu處理,用cck8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況、pi/annexin-v流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。然后我們將這一發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌ct26細(xì)胞小鼠移植瘤模型中進(jìn)行驗(yàn)證,應(yīng)用上述條件培養(yǎng)基處理聯(lián)合5-fu化療,動(dòng)態(tài)觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。3.5-fu可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過(guò)抑制p-jnk/caspase-3凋亡通路的激活,引起結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生耐藥。為了進(jìn)一步探明5-fu可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞引起結(jié)腸癌ct26細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生獲得性耐藥的機(jī)制。我們用分別用nm、cm和cm(5-fu)處理結(jié)腸癌ct26細(xì)胞,并給予5-fu處理,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表達(dá)。4.5-fu可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞多胺合成分泌增加,多胺可抑制由5-fu激活的p-jnk/caspase-3凋亡通路,從而使結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生耐藥。為了研究5-fu處理巨噬細(xì)胞后發(fā)生何種代謝改變或產(chǎn)生何種代謝產(chǎn)物進(jìn)而引起結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生獲得性耐藥。我們將經(jīng)或不經(jīng)5-fu處理的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清送做代謝芯片分析,從而找出引起結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-fu產(chǎn)生獲得性耐藥的代謝改變或是代謝產(chǎn)物。然后我們用該代謝產(chǎn)物特異性抑制劑和5-fu共同處理巨噬細(xì)胞后收集其培養(yǎng)上清,標(biāo)記為cm(5-fu+inhibitor)。然后分別用nm、cm(5-fu)和cm(5-fu+inhibitor)處理結(jié)腸癌ct26細(xì)胞,并給予5-fu處理,westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表達(dá)。然后我們將這一發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌ct26細(xì)胞小鼠移植瘤模型中進(jìn)行驗(yàn)證,應(yīng)用上述條件培養(yǎng)基處理聯(lián)合5-fu化療,動(dòng)態(tài)觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)論:1.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)5-fu處理組ct26細(xì)胞凋亡數(shù)目較對(duì)照組顯著增加,同時(shí)westernblot也發(fā)現(xiàn)5-fu處理組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表達(dá)較對(duì)照組也顯著升高。進(jìn)一步在結(jié)腸癌ct26細(xì)胞小鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn),運(yùn)用P-JNK特異性抑制劑抑制P-JNK/caspase-3凋亡信號(hào)通路后再給予5-FU化療,其化療效果明顯降低。由此,我們提出5-FU可通過(guò)激活結(jié)腸癌CT26細(xì)胞P-JNK/caspase-3凋亡信號(hào)通路以發(fā)揮其抗癌效應(yīng)的結(jié)論。2.用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)CM(5-FU)能顯著降低結(jié)腸癌CT26細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性,而CM則無(wú)此作用。在皮下瘤模型中,我們統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)CM(5-FU)組用或不用5-FU化療,腫瘤平均直徑的變化量較NM組顯著減少,化療敏感性顯著降低,而CM組用或不用5-FU化療腫瘤平均直徑的變化量較NM組則無(wú)明顯差異。由此,得到了5-FU可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞引起結(jié)腸癌CT26細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生獲得性耐藥的結(jié)論。3.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn),CM(5-FU)顯著減少由5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的細(xì)胞凋亡數(shù)目。western blot也發(fā)現(xiàn)CM(5-FU)能顯著抑制由5-FU有誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白P-JNK、caspase-3的表達(dá)。因此可以推斷,5-FU可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過(guò)抑制P-JNK/caspase-3凋亡通路的激活,引起結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生獲得性耐藥。4.代謝芯片分析發(fā)現(xiàn),5FU可刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生代謝改變,其中多胺合成代謝的改變可能與結(jié)腸癌耐藥相關(guān)。進(jìn)一步western blot驗(yàn)證了用多胺合成酶抑制劑(DFMO)可顯著減弱CM(5-FU)對(duì)由5-FU激活P-JNK/caspase-3凋亡通路的抑制作用,使P-JNK、caspase-3的表達(dá)得到回復(fù)。在皮下瘤模型中也證實(shí),CM(5-FU+DFMO)組化療敏感性較CM(5-FU)顯著增加。由此可推測(cè)5-FU可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞多胺合成分泌增加,而多胺可抑制由5-FU引起的P-JNK/caspase-3凋亡通路的激活,從而使結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生獲得性耐藥。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳玉娟;張璇;郝麗君;繆洪明;梁后杰;;巨噬細(xì)胞在結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞獲得性5-FU耐藥中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2016年06期

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本文編號(hào)：1276478