本文關(guān)鍵詞：順鉑聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞及其裸鼠原位移植瘤的影響

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【摘要】：目的:1探討順鉑分別聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制;2探討順鉑分別聯(lián)合雷帕霉素、3-MA對(duì)裸鼠肺腺癌A549細(xì)胞癌原位移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用和相關(guān)機(jī)制。方法:一對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的處理1將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化、收獲、計(jì)數(shù),調(diào)整濃度為1.0×106/ml,每孔200μl接種到96孔板中,過(guò)夜貼壁后加入雷帕霉素(RAPA,rapamycin),使其終濃度分別為0.1nmol/L,1.0nmol/L,10.0nmol/L,100.0nmol/L,未加藥的對(duì)照組和加藥組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板置37℃、5%CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后,每孔中加入MTT(濃度5mg/m L)20μL,置37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)孵育4h,小心棄上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,震蕩5min,用Bio-Rad酶標(biāo)儀在測(cè)試波長(zhǎng)為570nm,濾過(guò)波長(zhǎng)為655nm處讀取吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組平均A值-加藥組平均A值)/對(duì)照組平均A值×100%抑制率(%)=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)100%,同樣的方法用于順鉑和3MA。然后用graphpad prism 5軟件計(jì)算出各藥物的50%細(xì)胞抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50),順鉑(DDP)IC50:15μmol/L,雷帕霉素IC50:10nmol/L,3-MAIC50:3μmol/L,并以此作為實(shí)驗(yàn)濃度。2將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化,將A549細(xì)胞分別以每孔1.0×106/ml密度接種于六孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積約70%-80%后分別加入稀釋好的藥物。本實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組(無(wú)任何藥物干預(yù)的A549細(xì)胞)、順鉑組(在A549細(xì)胞中加15μmol/L的DDP)、順鉑+雷帕霉素組(加10nmol/L的RAPA 1h后再加15μmol/L的DDP)、順鉑+3-MA組(加3μmol/L的3-MA 1h后再加15μmol/L的DDP),分別均培養(yǎng)24h、48h、72h后進(jìn)行檢測(cè)。3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)用藥后24h、48h、72h肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的情況。4 Real time RT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)不同藥物作用24h、48、72h后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax m RNA的表達(dá)情況。5 Western blot方法檢測(cè)A549細(xì)胞經(jīng)不同藥物作用48、72h后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表達(dá)水平。二對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞癌原位移植瘤的處理1將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用0.25%胰酶消化,調(diào)整成終濃度為1.0×107/ml,用1ml注射器注射到裸鼠右側(cè)腋部皮下,每只0.2ml,共接種24只,飼養(yǎng)約15d(此時(shí)裸鼠腫瘤大小達(dá)到1cm3左右),將建立好的裸鼠肺腺癌A549細(xì)胞原位移植瘤模型隨機(jī)分為4組,每組6只,即對(duì)照組(生理鹽水組)、順鉑組(2mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+雷帕霉素(1mg/kg)、順鉑(2mg/kg)+3-MA組(2mg/kg),腹腔注射給藥15天,每只裸鼠注射計(jì)量為0.2ml/天,對(duì)照組和順鉑組每天注射一次,聯(lián)合用藥組為隔天注射一次。用藥期間記錄裸鼠飲食和精神狀態(tài)變化,測(cè)量裸鼠體重和腫瘤大小,用藥結(jié)束后處死全部裸鼠,完整剝除瘤體,測(cè)量腫瘤大小、計(jì)算腫瘤抑制率、HE染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。2 Real time RT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型經(jīng)藥物作用后m TOR、LC3-Ⅱ及Bax m RNA的表達(dá)情況。3 Western blot方法及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型經(jīng)藥物作用后瘤體中m TOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:一不同藥物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用1順鉑、雷帕霉素、3-MA單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí),均表現(xiàn)為抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,且呈時(shí)間和濃度依賴性,作用時(shí)間越長(zhǎng),藥物濃度越大,對(duì)細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。2比較四個(gè)分組中藥物對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用:24h時(shí)間點(diǎn),順鉑聯(lián)合雷帕霉素對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng);而48h和72h時(shí)間點(diǎn),順鉑聯(lián)合3-MA對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。3不同藥物對(duì)A549細(xì)胞殺傷性的病理學(xué)形態(tài)觀察倒置顯微鏡下觀察A549細(xì)胞經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組(對(duì)照組、順鉑組、順鉑+雷帕霉素組、順鉑+3-MA組)處理后細(xì)胞的形態(tài)變化。培養(yǎng)24h時(shí)細(xì)胞數(shù)目略有減少,順鉑組、順鉑+3-MA組、順鉑+雷帕霉素組對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用依次增強(qiáng)。表現(xiàn)為A549細(xì)胞體積變小、變圓并皺縮,折光性差,排列疏松,核漿比變大,貼壁能力減弱,有些細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多顆粒,并出現(xiàn)飄浮的細(xì)胞;培養(yǎng)48h后細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)減少,胞漿內(nèi)顆粒增多,且可見(jiàn)細(xì)胞碎片,貼壁細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。順鉑組、順鉑+雷帕霉素組、順鉑+3-MA組對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用依次增強(qiáng)。對(duì)照組肺癌細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng),狀況良好。培養(yǎng)72h后細(xì)胞數(shù)目大量減少,可見(jiàn)明顯的細(xì)胞碎片,貼壁細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組顯著減少。對(duì)照組肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)擁擠,狀況欠佳。4 Real time RT-PCR結(jié)果顯示(1)24h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,0.667±0.013,0.418±0.007,0.684±0.024,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。24h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.489±0.031,1.686±0.069,1.376±0.033,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。24h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.915±0.041,1.467±0.062,1.324±0.060,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)48h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.796±0.003,0.732±0.007,0.645±0.008,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。48h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.325±0.007,1.803±0.083,1.253±0.072,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。48h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.346±0.080,1.133±1.125,1.864±0.104,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,0.749±0.030,0.636±0.034,0.583±0.008,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.428±0.080,1.836±0.056,1.153±0.011,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax m RNA的2-△△CT值為1.000±1.000,1.462±0.029,1.117±0.070,1.935±0.068,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 Western blot結(jié)果顯示(1)48h各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR的相對(duì)表達(dá)量分別為1.096±0.036,0.608±0.018,0.454±0.051,0.447±0.011,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。48h各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量分別為0.228±0.018,0.426±0.010,0.556±0.010,0.355±0.009,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。48h各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax的相對(duì)表達(dá)量分別為0.253±0.006,0.463±0.011,0.392±0.006,0.897±0.022,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR的相對(duì)表達(dá)量分別為1.132±0.007,0.573±0.025,0.402±0.009,0.364±0.009,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量分別為0.239±0.008,0.492±0.009,0.571±0.009,0.278±0.009,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。72h時(shí)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax的相對(duì)表達(dá)量分別為0.248±0.006,0.581±0.007,0.287±0.009,0.916±0.005,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二不同藥物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤的作用1 24只裸鼠均成瘤,成瘤率為100%。用藥期間各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見(jiàn)明顯異常;用藥前各組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.4±2.1g,18.6±2.7g,18.9±1.9g,17.8±2.1g,P0.05),用藥后第一天測(cè)量各組裸鼠體重,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(29.1±1.2g,29.4±0.9g,29.7±1.3g,18.9±2.6g,P0.05)。藥物治療期間各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)裸鼠腫瘤體積的腫瘤大小分別為1.110±0.035,0.705±0.033,0.623±0.042,0.500,腫瘤的抑制率分別為0%,36.5%,43.9%,55.0%,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2各組裸鼠原位移植瘤形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:顯微鏡下觀察HE染色切片,裸鼠原位移植瘤的瘤組織呈低分化肺腺癌,癌細(xì)胞異形性明顯,核大深染,細(xì)胞形態(tài)多樣,核染色質(zhì)呈粗顆粒狀。3 Real time RT-PCR結(jié)果顯示:(1)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR m RNA的2-△△CT為1.000±1.000,0.753±0.007,0.635±0.008,0.593±0.012,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱm RNA的2-△△CT為1.000±1.000,1.316±0.006、1.733±0.007,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax m RNA的2-△△CT為1.000±1.000,1.323±0.008,0.1.178±0.010,1.756±0.024,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 Western blot結(jié)果顯示:(1)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR的相對(duì)表達(dá)量分別為1.290±0.028,0.694±0.017,0.522±0.002,0.485±0.004,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量分別為0.330±0.008,0.581±0.008,0.685±0.008,0.383±0.005,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax的相對(duì)表達(dá)量分別為0.258±0.006,0.594±0.008,0.296±0.008,0.919±0.020,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5免疫組織化學(xué)結(jié)果:各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)m TOR免疫反應(yīng)積分中位數(shù)為8,6,5,4,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)LC3-Ⅱ免疫反應(yīng)積分中位數(shù)為2,4,6,3,各用藥組與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+RAPA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組(對(duì)照組,DDP組,DDP+RAPA組,DDP+3-MA組)Bax的免疫反應(yīng)反應(yīng)積分中位數(shù)為2,5,3,7,各用藥組與對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DDP+3-MA組與DDP組相比,表達(dá)量顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:一不同藥物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用1順鉑聯(lián)合雷帕霉素、順鉑聯(lián)合3-MA均可以對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,且該作用大于單獨(dú)使用順鉑對(duì)癌細(xì)胞造成的抑制作用。2順鉑聯(lián)合雷帕霉素與順鉑聯(lián)合3-MA相比,24h時(shí)前者的對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用大于后者,而48h和72h時(shí)結(jié)果相反。3順鉑+雷帕霉素組在24h時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)顯著高于其它組,而在48h和72h順鉑+3-MA組Bax表達(dá)顯著升高。提示早期順鉑+雷帕霉素組可能因自噬占據(jù)細(xì)胞死亡的主導(dǎo)地位,而后期(順鉑+3-MA組)可能因抑制自噬反而激活凋亡,使癌細(xì)胞大量死亡。二不同藥物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠原位移植瘤的作用順鉑+雷帕霉素組、順鉑+3-MA組均可以抑制肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),且抑制作用均大于單獨(dú)使用順鉑時(shí)對(duì)腫瘤的抑制作用。提示雷帕霉素、3-MA均可以提高順鉑的化療敏感性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：1276006