發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 19:30

  本文關(guān)鍵詞：TRIM28在腫瘤中的表達(dá)分析及其與腫瘤相關(guān)性機(jī)制研究

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【摘要】：目的:①構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒,建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)pcDNA5-TRIM28-HEK293細(xì)胞系。②探討TRIM28基因在分子水平的調(diào)控作用及其在腫瘤中的表達(dá)。③TRIM28與腫瘤相關(guān)性及機(jī)制分析。方法:首先,經(jīng)PCR技術(shù)、酶切消化、測(cè)序驗(yàn)證和免疫印跡雜交技術(shù),成功構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系。其次,提取TRIM28-HEK293細(xì)胞系蛋白質(zhì),同時(shí)設(shè)立對(duì)照,通過(guò)雙向電泳,質(zhì)譜鑒定,鑒定出TRIM28調(diào)節(jié)的靶基因,并設(shè)計(jì)靶基因引物。選取DOX最佳誘導(dǎo)時(shí)間(12h)和最佳誘導(dǎo)劑量(0.1μg/ml)誘導(dǎo)可穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系,提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由11對(duì)基因的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證雙向電泳的結(jié)果。同時(shí)在HeLa細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TRIM28,轉(zhuǎn)染24h后提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由11對(duì)基因的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,進(jìn)一步驗(yàn)證雙向電泳的結(jié)果。再次,提取7種不同腫瘤細(xì)胞系RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)TRIM28在不同腫瘤細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本,提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)TRIM28在癌旁正常組織和腫瘤組織中mRNA表達(dá)水平的差異。在4T1細(xì)胞系或者HeLa細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TRIM28,分別提取RNA及蛋白質(zhì),通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)TRIM28、TWIST1與腫瘤的相關(guān)性及機(jī)制。結(jié)果:成功構(gòu)建pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)trim28-hek293細(xì)胞系。將pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和pog44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入hek-293細(xì)胞系中,用潮霉素b篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染了空載體的對(duì)照組flp-intmt-rextm-293細(xì)胞系中,無(wú)論加dox誘導(dǎo)還是未加dox誘導(dǎo),都不會(huì)檢測(cè)到trim28的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染了pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和pog44質(zhì)粒的flp-intmt-rextm-293細(xì)胞系中,未加dox誘導(dǎo)的一組同樣檢測(cè)不到trim28的表達(dá),而在加入適量dox誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組中,trim28明顯有較高水平的表達(dá)。通過(guò)分析結(jié)果可以進(jìn)一步證明可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)trim28-hek293細(xì)胞系構(gòu)建成功。提取可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)trim28-hek293細(xì)胞系蛋白質(zhì),進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)受trim28調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)基因,其中上調(diào)基因有3個(gè)、下調(diào)基因有8個(gè)。根據(jù)雙向電泳中檢測(cè)出的trim28調(diào)節(jié)的11個(gè)靶基因設(shè)計(jì)引物,dox誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)trim28-hek293細(xì)胞系,提取rna,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè);并在hela細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)trim28,同樣進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè),分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分驗(yàn)證了雙向電泳的結(jié)果,trim28具有調(diào)控的作用,可上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達(dá)。提取7種不同腫瘤細(xì)胞系rna,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在mda-mb-231細(xì)胞系、t47d細(xì)胞系、mcf-7細(xì)胞系、mda-mb-435細(xì)胞系及hek293細(xì)胞系中,trim28mrna的表達(dá)水平都顯著升高,這表明trim28mrna的表達(dá)與腫瘤有關(guān)。收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本,提取組織標(biāo)本rna,通過(guò)熒光定量pcr檢測(cè),分析熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組織標(biāo)本相比,在乳腺癌腫瘤組織標(biāo)本中trim28mrna的表達(dá)水平顯著增高,約是正常組織trim28mrna表達(dá)的近4倍,這表明trim28的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。在具有內(nèi)源性表達(dá)twist1的4t1細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)trim28,通過(guò)兩次的westernblot結(jié)果本實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn),4t1細(xì)胞系過(guò)表達(dá)TRIM28后,與只轉(zhuǎn)染了空載體的對(duì)照組相比,TWIST1的蛋白表達(dá)水平明顯升高。通過(guò)蛋白質(zhì)灰度分析發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)TRIM28后,兩次試驗(yàn)結(jié)果TWIST1蛋白水平表達(dá)都增高,分別是對(duì)照組的1.28倍和1.71倍。TWIST1是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要基因,過(guò)表達(dá)TRIM28后TWIST1表達(dá)相應(yīng)升高,表明在腫瘤中,TRIM28的表達(dá)與TWIST1的表達(dá)具有相關(guān)性,TRIM28在腫瘤發(fā)生中起到重要作用可能是通過(guò)調(diào)控TWIST1來(lái)進(jìn)行的,TRIM28能夠穩(wěn)定TWIST1蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在4T1細(xì)胞系中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)又在HeLa細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TRIM28,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TRIM28提高了HeLa細(xì)胞系中TWIST1的蛋白表達(dá)水平,mRNA水平的表達(dá)反而降低。結(jié)論:成功建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)TRIM28-HEK293細(xì)胞系;通過(guò)雙向電泳和熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)受TRIM28調(diào)節(jié)的11個(gè)靶基因。通過(guò)提取7種不同腫瘤細(xì)胞系RNA和44例組織標(biāo)本RNA,發(fā)現(xiàn)TRIM28在m RNA表達(dá)水平與腫瘤有相關(guān)性。通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)TRIM28在蛋白質(zhì)表達(dá)水平與TWIST 1蛋白質(zhì)的表達(dá)有相關(guān)性,進(jìn)一步證明TRIM28與腫瘤的相關(guān)性,TRIM28在腫瘤中發(fā)揮重要作用,但是對(duì)于TRIM28是否是通過(guò)調(diào)節(jié)TWIST調(diào)控腫瘤的發(fā)生及對(duì)于TRIM28是如何調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的,還需要進(jìn)一步的研究證明。
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 田利源;陳紅星;鄧?yán)^先;;一個(gè)新的與泛素化有關(guān)的蛋白家族——TRIM家族[J];生物技術(shù)通訊;2007年02期

2 江建新;詹磊;黃洋;何燕浙;孫誠(chéng)誼;;KAP-1在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J];世界華人消化雜志;2013年09期

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本文編號(hào)：1275641