本文關(guān)鍵詞：TRIM28在腫瘤中的表達分析及其與腫瘤相關(guān)性機制研究

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【摘要】：目的:①構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒,建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達pcDNA5-TRIM28-HEK293細胞系。②探討TRIM28基因在分子水平的調(diào)控作用及其在腫瘤中的表達。③TRIM28與腫瘤相關(guān)性及機制分析。方法:首先,經(jīng)PCR技術(shù)、酶切消化、測序驗證和免疫印跡雜交技術(shù),成功構(gòu)建pcDNA5-TRIM28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系。其次,提取TRIM28-HEK293細胞系蛋白質(zhì),同時設(shè)立對照,通過雙向電泳,質(zhì)譜鑒定,鑒定出TRIM28調(diào)節(jié)的靶基因,并設(shè)計靶基因引物。選取DOX最佳誘導(dǎo)時間(12h)和最佳誘導(dǎo)劑量(0.1μg/ml)誘導(dǎo)可穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系,提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由11對基因的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增,驗證雙向電泳的結(jié)果。同時在HeLa細胞系中過表達TRIM28,轉(zhuǎn)染24h后提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由11對基因的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增,進一步驗證雙向電泳的結(jié)果。再次,提取7種不同腫瘤細胞系RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增,通過熒光定量PCR檢測TRIM28在不同腫瘤細胞系中mRNA的表達水平。同時本實驗收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本,提取RNA,在逆轉(zhuǎn)酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增,通過熒光定量PCR檢測TRIM28在癌旁正常組織和腫瘤組織中mRNA表達水平的差異。在4T1細胞系或者HeLa細胞系中過表達TRIM28,分別提取RNA及蛋白質(zhì),通過熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測TRIM28、TWIST1與腫瘤的相關(guān)性及機制。結(jié)果:成功構(gòu)建pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達trim28-hek293細胞系。將pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和pog44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入hek-293細胞系中,用潮霉素b篩選陽性克隆。經(jīng)westernblot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染了空載體的對照組flp-intmt-rextm-293細胞系中,無論加dox誘導(dǎo)還是未加dox誘導(dǎo),都不會檢測到trim28的表達。而在共轉(zhuǎn)染了pcdna5-trim28重組質(zhì)粒和pog44質(zhì)粒的flp-intmt-rextm-293細胞系中,未加dox誘導(dǎo)的一組同樣檢測不到trim28的表達,而在加入適量dox誘導(dǎo)的實驗組中,trim28明顯有較高水平的表達。通過分析結(jié)果可以進一步證明可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達trim28-hek293細胞系構(gòu)建成功。提取可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達trim28-hek293細胞系蛋白質(zhì),進行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個受trim28調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)基因,其中上調(diào)基因有3個、下調(diào)基因有8個。根據(jù)雙向電泳中檢測出的trim28調(diào)節(jié)的11個靶基因設(shè)計引物,dox誘導(dǎo)穩(wěn)定表達trim28-hek293細胞系,提取rna,反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量pcr檢測;并在hela細胞系中過表達trim28,同樣進行熒光定量pcr檢測,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分驗證了雙向電泳的結(jié)果,trim28具有調(diào)控的作用,可上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達。提取7種不同腫瘤細胞系rna,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量pcr檢測發(fā)現(xiàn),在mda-mb-231細胞系、t47d細胞系、mcf-7細胞系、mda-mb-435細胞系及hek293細胞系中,trim28mrna的表達水平都顯著升高,這表明trim28mrna的表達與腫瘤有關(guān)。收集了11例癌旁正常乳腺組織標(biāo)本和33例乳腺腫瘤組織標(biāo)本,提取組織標(biāo)本rna,通過熒光定量pcr檢測,分析熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組織標(biāo)本相比,在乳腺癌腫瘤組織標(biāo)本中trim28mrna的表達水平顯著增高,約是正常組織trim28mrna表達的近4倍,這表明trim28的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。在具有內(nèi)源性表達twist1的4t1細胞系中過表達trim28,通過兩次的westernblot結(jié)果本實驗均發(fā)現(xiàn),4t1細胞系過表達TRIM28后,與只轉(zhuǎn)染了空載體的對照組相比,TWIST1的蛋白表達水平明顯升高。通過蛋白質(zhì)灰度分析發(fā)現(xiàn),過表達TRIM28后,兩次試驗結(jié)果TWIST1蛋白水平表達都增高,分別是對照組的1.28倍和1.71倍。TWIST1是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要基因,過表達TRIM28后TWIST1表達相應(yīng)升高,表明在腫瘤中,TRIM28的表達與TWIST1的表達具有相關(guān)性,TRIM28在腫瘤發(fā)生中起到重要作用可能是通過調(diào)控TWIST1來進行的,TRIM28能夠穩(wěn)定TWIST1蛋白。為了進一步驗證在4T1細胞系中的實驗結(jié)果,本實驗又在HeLa細胞系中過表達TRIM28,通過熒光定量PCR檢測及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),TRIM28提高了HeLa細胞系中TWIST1的蛋白表達水平,mRNA水平的表達反而降低。結(jié)論:成功建立可誘導(dǎo)穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系;通過雙向電泳和熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)并檢測受TRIM28調(diào)節(jié)的11個靶基因。通過提取7種不同腫瘤細胞系RNA和44例組織標(biāo)本RNA,發(fā)現(xiàn)TRIM28在m RNA表達水平與腫瘤有相關(guān)性。通過Western blot發(fā)現(xiàn)TRIM28在蛋白質(zhì)表達水平與TWIST 1蛋白質(zhì)的表達有相關(guān)性,進一步證明TRIM28與腫瘤的相關(guān)性,TRIM28在腫瘤中發(fā)揮重要作用,但是對于TRIM28是否是通過調(diào)節(jié)TWIST調(diào)控腫瘤的發(fā)生及對于TRIM28是如何調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的,還需要進一步的研究證明。
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 田利源;陳紅星;鄧繼先;;一個新的與泛素化有關(guān)的蛋白家族——TRIM家族[J];生物技術(shù)通訊;2007年02期

2 江建新;詹磊;黃洋;何燕浙;孫誠誼;;KAP-1在胰腺癌中的表達及臨床意義[J];世界華人消化雜志;2013年09期

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