本文關(guān)鍵詞：頭頸鱗狀細(xì)胞癌中miR-645的表達(dá)及其功能的研究

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【摘要】：研究背景頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)主要包括來(lái)自口腔的、口咽的和喉部的腫瘤,并在全球惡性腫瘤中排第六位。在過(guò)去的30年中其生存率并沒(méi)有明顯的提高,并且約有50%的患者在確診后5年內(nèi)因該病去世。超過(guò)50%的頭頸鱗癌病人都受到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的困擾,并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是與患者較差的長(zhǎng)期生存率密切相關(guān)的最重要預(yù)后因素之一。目前最有效的治療手段仍然是手術(shù),只有盡早發(fā)現(xiàn),并盡早采取措施才有可能將腫瘤徹底切除,防止腫瘤進(jìn)展,保證患者的生命健康。Micro RNA作為一種重要的內(nèi)源性RNA分子體系,在動(dòng)物中通過(guò)與其同源的m RNA靶標(biāo)的3’UTR這一特定序列相互作用從而發(fā)揮基因調(diào)控作用,導(dǎo)致了其靶標(biāo)m RNA的降解或其翻譯過(guò)程受到抑制�，F(xiàn)在已經(jīng)非�？隙ǖ拿鞔_了mi RNAs在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等重要的細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。已經(jīng)有一部分mi RNA被識(shí)別并被確認(rèn)為惡性腫瘤的診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物。目前,頭頸鱗癌的治愈率仍然不高,所以非常有必要尋找與頭頸鱗癌相關(guān)的高靈敏度和特異性的mi RNA分子,作為頭頸鱗癌診斷或治療的標(biāo)志物。在本項(xiàng)研究中,我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸鱗癌樣本中的mi R-645表達(dá)水平,并分析其表達(dá)與頭頸鱗癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。首先,我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在2株頭頸鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將mi R-645mimics或mi R-645inhabitor轉(zhuǎn)入頭頸鱗癌細(xì)胞株,從而上調(diào)或下調(diào)mi R-645的表達(dá)水平。然后通過(guò)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況,應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力,以了解mi R-645對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響,以進(jìn)一步闡明mi R-645在頭頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。并通過(guò)線性回歸分析分析了mi R-645與其可能的靶基因IFIT2的關(guān)系,為以后深入研究mi R-645的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。第一部分探究mi R-645在不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析目的研究mi R-645在不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸鱗癌組織中和細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)取自頭頸鱗癌患者的癌組織中的mi R-645的表達(dá)水平,其中包括:76例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌組織和51例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌組織。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法研究其表達(dá)水平與患者年齡、性別、臨床分期等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果1.mi R-645在不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平。通過(guò)real-time PCR技術(shù)檢測(cè)mi R-645在不同轉(zhuǎn)移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的76例頭頸鱗癌組織中的mi R-645的相對(duì)表達(dá)量是2.71±0.24,而在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的51例頭頸鱗癌組織中則為1.58±0.23,兩者對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。2.采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析研究mi R-645的表達(dá)水平與頭頸鱗癌的臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明mi R-645的表達(dá)水平與腫瘤的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管栓塞、浸潤(rùn)神經(jīng)、彌漫性浸潤(rùn)等反應(yīng)腫瘤惡性程度病理指標(biāo)呈顯著相關(guān)(p0.05),而與頭頸鱗癌患者的性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤的發(fā)生部位、吸煙史和飲酒史均無(wú)明顯相關(guān)性(p0.05)。小結(jié)1.伴有轉(zhuǎn)移特性的頭頸鱗癌組織中的mi R-645的表達(dá)水平明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移特性的頭頸鱗癌組織,提示mi R-645的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移能力。2.頭頸鱗癌組織中mi R-645的表達(dá)水平與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤惡性程度指征(腫瘤內(nèi)血管栓塞、浸潤(rùn)神經(jīng)、彌漫性浸潤(rùn))顯著相關(guān),提示mi R-645可能在頭頸鱗癌的發(fā)生及發(fā)展階段起關(guān)鍵性作用,有成為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛能。第二部分mi R-645對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目的通過(guò)外源性干預(yù)措施改變mi R-645的表達(dá)水平,研究其對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞系HN4和HN12生物學(xué)行為的影響及并探索其機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法檢測(cè)兩株頭頸鱗癌細(xì)胞系HN4和HN12中的mi R-645的表達(dá)水平,并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式將mi R-645mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)入HN4細(xì)胞中,以獲得高表達(dá)mi R-645細(xì)胞模型,同時(shí)分為三組:空白組、陰性對(duì)照組(NC組)和轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組;轉(zhuǎn)染mi R-645inhabitor進(jìn)入HN12細(xì)胞中,以獲得低表達(dá)mi R-645細(xì)胞模型,同時(shí)分為三組:無(wú)轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組(inhabitor-NC組)和轉(zhuǎn)染mi R-645inhabitor組。然后通過(guò)CCK8法檢測(cè)頭頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)頭頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力、轉(zhuǎn)移能力和克隆形成能力的影響。此外,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(線性回歸分析)探測(cè)mi R-645與IFIT2之間的關(guān)系。結(jié)果1、實(shí)時(shí)定量PCR證明轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的HN12細(xì)胞比轉(zhuǎn)移能力較弱的HN4細(xì)胞mi R-645表達(dá)水平要高,結(jié)果分別為:2.07±0.250和0.97±0.21,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。2、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組的HN4細(xì)胞中mi R-645的表達(dá)量顯著高于空白組和陰性對(duì)照組(p0.05)。轉(zhuǎn)染了mi R-645inhabitor組的HN12細(xì)胞中mi R-645的表達(dá)量顯著低于空白組和陰性對(duì)照組(p0.05)。3.轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組的HN4細(xì)胞的增值率在第5天和7天時(shí)明顯較陰性對(duì)照組高,并且差異有顯著性(p0.05)。轉(zhuǎn)染了mi R-645inhabitor組的HN12細(xì)胞的存活率在在第5天和7天時(shí)明顯較陰性對(duì)照組低,并且差異有顯著性(p0.05)。4.轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組的HN4細(xì)胞穿過(guò)PVDF膜的數(shù)量明顯高于陰性對(duì)照組,并且差異有顯著性(p0.05)。轉(zhuǎn)染了mi R-645inhabitor組的HN12細(xì)胞穿過(guò)PVDF膜的數(shù)量明顯低于陰性對(duì)照組,并且差異有顯著性(p0.05)。5.轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組的HN4細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯高于陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染了mi R-645inhabitor組的HN12細(xì)胞的侵襲數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組(p0.05)。6.轉(zhuǎn)染mi R-645mimics組的HN4細(xì)胞克隆形成能力明顯高于陰性對(duì)照組,并且差異有顯著性(p0.05)。轉(zhuǎn)染了mi R-645inhabitor組的HN12細(xì)胞的單克隆形成能力明顯低于陰性對(duì)照組,并且差異有顯著性(p0.05)。7.mi R-645與IFIT2之間呈負(fù)相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.181,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.001)。小結(jié)1.通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),成功的實(shí)現(xiàn)了頭頸鱗癌細(xì)胞中mi R-645的表達(dá)上調(diào)和下調(diào),并且上調(diào)mi R-645能夠增強(qiáng)頭頸鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及單克隆形成等能力,mi R-645能夠改變頭頸鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,可能發(fā)揮促癌作用。2.IFIT2可能是mi R-645下游靶基因,mi R-645可能通過(guò)調(diào)控IFIT2的表達(dá),進(jìn)而影響頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能。結(jié)論1.mi R-645在頭頸鱗癌組織中表達(dá)上調(diào),且與頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān);2.mi R-645的改變能夠明顯影響頭頸鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,有成為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛能;3.mi R-645可能通過(guò)直接調(diào)控IFIT2的表達(dá),進(jìn)而影響頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.91

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