本文關鍵詞：頭頸鱗狀細胞癌中miR-645的表達及其功能的研究

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【摘要】：研究背景頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)主要包括來自口腔的、口咽的和喉部的腫瘤,并在全球惡性腫瘤中排第六位。在過去的30年中其生存率并沒有明顯的提高,并且約有50%的患者在確診后5年內因該病去世。超過50%的頭頸鱗癌病人都受到淋巴結轉移的困擾,并且淋巴結轉移也是與患者較差的長期生存率密切相關的最重要預后因素之一。目前最有效的治療手段仍然是手術,只有盡早發(fā)現(xiàn),并盡早采取措施才有可能將腫瘤徹底切除,防止腫瘤進展,保證患者的生命健康。Micro RNA作為一種重要的內源性RNA分子體系,在動物中通過與其同源的m RNA靶標的3’UTR這一特定序列相互作用從而發(fā)揮基因調控作用,導致了其靶標m RNA的降解或其翻譯過程受到抑制。現(xiàn)在已經(jīng)非常肯定的明確了mi RNAs在細胞的增殖、分化和凋亡等重要的細胞生命活動中發(fā)揮重要的調控作用。已經(jīng)有一部分mi RNA被識別并被確認為惡性腫瘤的診斷和預后分子標志物。目前,頭頸鱗癌的治愈率仍然不高,所以非常有必要尋找與頭頸鱗癌相關的高靈敏度和特異性的mi RNA分子,作為頭頸鱗癌診斷或治療的標志物。在本項研究中,我們通過實時定量PCR技術檢測了不同轉移潛能的頭頸鱗癌樣本中的mi R-645表達水平,并分析其表達與頭頸鱗癌臨床病理參數(shù)的相關性。首先,我們應用實時定量PCR技術檢測其在2株頭頸鱗癌細胞中的表達水平。采用瞬時轉染的方法將mi R-645mimics或mi R-645inhabitor轉入頭頸鱗癌細胞株,從而上調或下調mi R-645的表達水平。然后通過CCK8法檢測細胞的增殖狀況,應用Transwell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力,通過劃痕實驗檢測細胞的遷移能力,通過克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力,以了解mi R-645對頭頸鱗癌細胞的生物學行為的影響,以進一步闡明mi R-645在頭頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。并通過線性回歸分析分析了mi R-645與其可能的靶基因IFIT2的關系,為以后深入研究mi R-645的分子機制奠定基礎。第一部分探究mi R-645在不同轉移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達及其與臨床參數(shù)的相關性分析目的研究mi R-645在不同轉移潛能的頭頸鱗癌組織中和細胞中的表達及臨床意義。方法采用實時定量PCR(real-time PCR)檢測取自頭頸鱗癌患者的癌組織中的mi R-645的表達水平,其中包括:76例伴有淋巴結轉移的頭頸鱗癌組織和51例無淋巴結轉移的頭頸鱗癌組織。通過獨立樣本t檢驗和單因素方差分析的統(tǒng)計方法研究其表達水平與患者年齡、性別、臨床分期等臨床病理參數(shù)之間的相關性。結果1.mi R-645在不同轉移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達水平。通過real-time PCR技術檢測mi R-645在不同轉移潛能的頭頸鱗癌組織中的表達水平。結果表明伴有淋巴結轉移的76例頭頸鱗癌組織中的mi R-645的相對表達量是2.71±0.24,而在無淋巴結轉移的51例頭頸鱗癌組織中則為1.58±0.23,兩者對比有統(tǒng)計學差異(p0.05)。2.采用t檢驗和單因素方差分析研究mi R-645的表達水平與頭頸鱗癌的臨床病理參數(shù)的相關性。結果表明mi R-645的表達水平與腫瘤的病理分級、淋巴結轉移及脈管栓塞、浸潤神經(jīng)、彌漫性浸潤等反應腫瘤惡性程度病理指標呈顯著相關(p0.05),而與頭頸鱗癌患者的性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤的發(fā)生部位、吸煙史和飲酒史均無明顯相關性(p0.05)。小結1.伴有轉移特性的頭頸鱗癌組織中的mi R-645的表達水平明顯高于無轉移特性的頭頸鱗癌組織,提示mi R-645的表達上調可能促進了頭頸鱗癌的轉移能力。2.頭頸鱗癌組織中mi R-645的表達水平與病理分級、淋巴結轉移、腫瘤惡性程度指征(腫瘤內血管栓塞、浸潤神經(jīng)、彌漫性浸潤)顯著相關,提示mi R-645可能在頭頸鱗癌的發(fā)生及發(fā)展階段起關鍵性作用,有成為腫瘤早期診斷標志物的潛能。第二部分mi R-645對頭頸鱗癌細胞生物學功能的影響目的通過外源性干預措施改變mi R-645的表達水平,研究其對頭頸鱗癌細胞系HN4和HN12生物學行為的影響及并探索其機制。方法采用實時定量PCR(real-time PCR)法檢測兩株頭頸鱗癌細胞系HN4和HN12中的mi R-645的表達水平,并通過瞬時轉染的方式將mi R-645mimics轉染進入HN4細胞中,以獲得高表達mi R-645細胞模型,同時分為三組:空白組、陰性對照組(NC組)和轉染mi R-645mimics組;轉染mi R-645inhabitor進入HN12細胞中,以獲得低表達mi R-645細胞模型,同時分為三組:無轉染組、陰性對照組(inhabitor-NC組)和轉染mi R-645inhabitor組。然后通過CCK8法檢測頭頸鱗癌細胞的增殖能力;Transwell侵襲實驗、劃痕實驗和克隆形成實驗分別檢測頭頸鱗癌細胞侵襲能力、轉移能力和克隆形成能力的影響。此外,通過統(tǒng)計學分析(線性回歸分析)探測mi R-645與IFIT2之間的關系。結果1、實時定量PCR證明轉移能力較強的HN12細胞比轉移能力較弱的HN4細胞mi R-645表達水平要高,結果分別為:2.07±0.250和0.97±0.21,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。2、實時定量PCR檢測結果顯示,轉染mi R-645mimics組的HN4細胞中mi R-645的表達量顯著高于空白組和陰性對照組(p0.05)。轉染了mi R-645inhabitor組的HN12細胞中mi R-645的表達量顯著低于空白組和陰性對照組(p0.05)。3.轉染mi R-645mimics組的HN4細胞的增值率在第5天和7天時明顯較陰性對照組高,并且差異有顯著性(p0.05)。轉染了mi R-645inhabitor組的HN12細胞的存活率在在第5天和7天時明顯較陰性對照組低,并且差異有顯著性(p0.05)。4.轉染mi R-645mimics組的HN4細胞穿過PVDF膜的數(shù)量明顯高于陰性對照組,并且差異有顯著性(p0.05)。轉染了mi R-645inhabitor組的HN12細胞穿過PVDF膜的數(shù)量明顯低于陰性對照組,并且差異有顯著性(p0.05)。5.轉染mi R-645mimics組的HN4細胞轉移能力明顯高于陰性對照組,轉染了mi R-645inhabitor組的HN12細胞的侵襲數(shù)明顯低于陰性對照組(p0.05)。6.轉染mi R-645mimics組的HN4細胞克隆形成能力明顯高于陰性對照組,并且差異有顯著性(p0.05)。轉染了mi R-645inhabitor組的HN12細胞的單克隆形成能力明顯低于陰性對照組,并且差異有顯著性(p0.05)。7.mi R-645與IFIT2之間呈負相關性,相關系數(shù)為0.181,且有統(tǒng)計學意義(p=0.001)。小結1.通過體外細胞實驗,成功的實現(xiàn)了頭頸鱗癌細胞中mi R-645的表達上調和下調,并且上調mi R-645能夠增強頭頸鱗癌細胞的增殖、侵襲、轉移及單克隆形成等能力,mi R-645能夠改變頭頸鱗癌細胞的生物學行為,可能發(fā)揮促癌作用。2.IFIT2可能是mi R-645下游靶基因,mi R-645可能通過調控IFIT2的表達,進而影響頭頸鱗癌細胞生物學功能。結論1.mi R-645在頭頸鱗癌組織中表達上調,且與頭頸鱗癌的轉移及預后密切相關;2.mi R-645的改變能夠明顯影響頭頸鱗癌細胞的增殖、侵襲及轉移等生物學行為,有成為腫瘤早期診斷標志物的潛能;3.mi R-645可能通過直接調控IFIT2的表達,進而影響頭頸鱗癌細胞生物學行為。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.91

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