本文關(guān)鍵詞：上調(diào)microRNA-34a對多發(fā)性骨髓瘤及其腫瘤干細(xì)胞特性影響的研究

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【摘要】：多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是起源于B細(xì)胞系的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,以骨髓內(nèi)單克隆漿細(xì)胞異常增生為特征。MM患者常有骨痛、貧血、腎功能不全以及反復(fù)感染等臨床表征,并產(chǎn)生溶骨性骨重吸收和骨生成障礙、骨髓瘤骨病等并發(fā)癥。盡管自體或異體造血干細(xì)胞移植治療MM已取得顯著療效,但仍未能達(dá)到根治效果。究其原因是腫瘤組織中存在一小部分腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSCs),具有無限增殖、自我更新、高致瘤以及耐受放化療能力。因此,靶向CSCs可能是特異性有效治療MM的手段之一。微小RNA (microRNA, miRNA)是一類在多種真核生物和病毒中產(chǎn)生的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,在細(xì)胞增殖、代謝、凋亡、衰老、分化等過程中發(fā)揮重要作用。研究證實,miRNA與腫瘤關(guān)系密切,以癌基因、抑癌基因或信號傳導(dǎo)分子等多種角色參與調(diào)控腫瘤的生物學(xué)過程；而miRNA在多種CSCs中異常表達(dá),參與維持眾多CSCs的惡性表型。MiRNA-34a作為miRNA-34家族成員之一,因具有引起腫瘤細(xì)胞G1期阻滯和凋亡的功能,被認(rèn)為是潛在的腫瘤生長抑制因子。文獻(xiàn)報道顯示,miR-34a在胰腺癌、腎癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤組織中異常表達(dá)。然而,miR-34a幾何在MM及其CSCs中發(fā)揮作用卻罕見報道�；谝陨涎芯勘尘�,本研究選擇人MM細(xì)胞系RPMI8226作為研究對象,構(gòu)建表達(dá)miR-34a的重組載體,利用普魯蘭精胺脂多糖納米材料(Pullulan-spermine (Ps) lipopolysaccharide- nanoparticle)將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,以完成miR-34a的過表達(dá);通過體內(nèi)外實驗和雙熒光報告質(zhì)粒分析,探討并驗證上調(diào)CSCs中miR-34a可否作為治療MM的新手段。目的：探討過表達(dá)miR-34a對人MM細(xì)胞及其CSCs的生物學(xué)特性影響,為靶向調(diào)控CSCs有效治療MM提供實驗依據(jù)。方法與內(nèi)容：1.構(gòu)建含有miR-34a的重組質(zhì)粒及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RPMI8226細(xì)胞克隆的篩選：RT-PCR鑒定人MM細(xì)胞系RPMI8226中IniR-34a的表達(dá)；構(gòu)建并鑒定pIRES-miR-34a重組載體。利用Ps材料將該重組載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入RPMI8226細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)miR-34a的細(xì)胞株,即ST (Stably transfected)-RPMI8226細(xì)胞。2.探究miR-34a對MM RPMI8226細(xì)胞及其CSCs的影響：通過CCK8、軟瓊脂克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)等實驗檢測ST和WT (Wild type)-RPMI8226細(xì)胞的增殖活性、體外克隆形成能力和抗凋亡能力。采用免疫磁珠分離技術(shù),依據(jù)細(xì)胞表面分子標(biāo)記,分別從MM ST-RPMI8226和WT-RPMI8226細(xì)胞系中篩選出表型為CD138-CD34-的CSCs,分別將ST和WT-RPMI8226細(xì)胞以及ST和WT-RPMI8226 CSCs經(jīng)皮下注射至非肥胖糖尿�。瘒�(yán)重的聯(lián)合型免疫缺陷(nonobese diabetic/severecombined immunodeficient, NOD/SCID)小鼠,觀察不同實驗組小鼠成瘤時間、生存期和腫瘤體積,通過骨骼CT掃描監(jiān)測骨密度改變,并應(yīng)用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色法從病理改變分析凋亡效應(yīng),以探討過表達(dá)miR-34a對MM RPMI8226及其CSCs在NOD/SCID鼠體內(nèi)致瘤能力的影響。3. MiR-34a通過抑制轉(zhuǎn)化生長相互作用因子2(Transforming growth interaction factor 2, TGI F2)的表達(dá)維持骨穩(wěn)態(tài)：利用生物信息學(xué)手段預(yù)測miR-34a的下游靶點(diǎn)TGIF2,并用雙熒光報告系統(tǒng)驗證。QPCR檢測轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的RPMI8226細(xì)胞中miR-34a和TGIF2 mRNA的表達(dá)水平,以及動物實驗所獲腫瘤組織中miR-34a和TGIF2 mRNA的表達(dá)水平；Western blot檢測各組種瘤組織中TGIF2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1. RT-PCR檢測證實在人MM細(xì)胞系RPMI8226中存在miR-34 a的低表達(dá)；成功構(gòu)建并鑒定miR-34a的重組載體pIRES-miR-34a。將構(gòu)建的真核重組表達(dá)載體通過Ps材料轉(zhuǎn)染至RPMI8226細(xì)胞48h后,細(xì)胞中miR-34a的含量顯著增加；經(jīng)G418成功篩選并鑒定出穩(wěn)定表達(dá)niR-34a的細(xì)胞株ST-RPMI8226,差異均有顯著性意義(P0.05或P0.01)。2.體外實驗結(jié)果顯示,相對于WT-RPMI8226細(xì)胞,ST-RPMI8226細(xì)胞的增殖能力受到抑制、克隆形成能力減弱,凋亡率增加；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,WT-RPMI8226田胞和WT-RPMI8226 CSCs在致瘤能力和腫瘤大小等方面強(qiáng)于ST-RPM18226細(xì)胞和ST-RPMI8226 CSCs,骨掃描和HE染色結(jié)果均得到一致結(jié)果,差異均有顯著性意義(P0.05或P0.01)。3.生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光報告系統(tǒng)結(jié)果顯示,TGIF2是miR-34a的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。QPCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了miR-34a mimics的RPMI8226細(xì)胞niR-34a的表達(dá)量顯著增高而TGIF2含量有所降低；對NOD/SCID小鼠腫瘤組織進(jìn)行的檢測結(jié)果也顯示了相同的結(jié)果,差異均有顯著性意義(P0.05或P0.01)。結(jié)論：1.過表達(dá)miR-34a可在一定程度上降低人MM細(xì)胞系RPMI8226在體外的克隆形成能力、增殖能力及體內(nèi)致瘤能力,同時增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率,從而抑制MM的生長。2.過表達(dá)niR-34a可減弱MM CD138-CD34-CSCs的致瘤性,減低TGIF2表達(dá)及骨損傷,提示miR-34a或其調(diào)控的下游分子TGIF2可作為MM治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 竇駿;;腫瘤干細(xì)胞研究面臨的挑戰(zhàn)與對策[J];生物技術(shù)通訊;2009年04期

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本文編號：1259881