本文關(guān)鍵詞：ANXA2對結(jié)直腸癌發(fā)展的影響及信號(hào)通路的初步研究

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【摘要】：背景與目的結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一,是多因素作用、多基因參與、多階段形成的復(fù)雜病理過程,其發(fā)病率以及死亡率具有逐年上升的趨勢,嚴(yán)重威脅著人類的生命及健康安全。結(jié)直腸癌的臨床治療主要包括手術(shù)、放療、化療、熱療及免疫治療及傳統(tǒng)的中醫(yī)治療,目前手術(shù)仍然是最主要而且最有效的方法,但是術(shù)后5年生存率卻只有50%。結(jié)直腸癌早期診斷困難、早期轉(zhuǎn)移常見、對化療的抗性以及化療的巨大毒性等都使其治療與預(yù)后變得異常艱難。因此,對結(jié)直腸癌的早期診斷與新的治療手段如基因治療、靶向治療等的研究就顯得很重要。近年來研究已經(jīng)證實(shí),膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)是與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因,其表達(dá)在人類絕大多數(shù)腫瘤中均上調(diào),這種過表達(dá)現(xiàn)象可能與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。研究基因的功能常用基因敲除(Gene deletion)或基因敲低(Gene inhibition)方法,前者是目前應(yīng)用較為廣泛的基因組編輯技術(shù)之一,其完全徹底、高度特異性的對靶基因表達(dá)的去除作用使其發(fā)展成為基因功能研究強(qiáng)有力的手段。本研究采用傳統(tǒng)基因敲除技術(shù),從基因組水平徹底消除ANXA2基因在人結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞中的表達(dá),從而建立了完全無ANXA2表達(dá)的caco2細(xì)胞系(ANXA2-/-caco2)。并通過對這種完全無ANXA2表達(dá)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)等特性的檢測,探索ANXA2基因?qū)aco2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在此基礎(chǔ)上,利用雙向電泳以及質(zhì)譜分析等技術(shù)對ANXA2基因敲除結(jié)直腸癌細(xì)胞蛋白組學(xué)進(jìn)行初步研究,試圖揭示ANXA2基因敲除對結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞蛋白組的影響,獲得可能與ANXA2功能相關(guān)的基因成員,初步了解4NXA2在結(jié)直腸癌中的作用及可能的信號(hào)通路組成,為進(jìn)一步深入研究ANXA2在結(jié)直腸癌中的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)導(dǎo)奠定初步基礎(chǔ)。此外,為了對文獻(xiàn)多次報(bào)道的與ANXA2功能關(guān)系密切的組織纖溶酶原激活因子(Tissue plasminogen activator, tPA)基因功能進(jìn)行研究,并與ANXA2基因敲除形成互對應(yīng)研究,本研究曾試圖以轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcriptional activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)為靶向基因編輯工具,試圖從人結(jié)直腸癌細(xì)胞caco2細(xì)胞中將tPA基因敲除,以期得到tPA敲除的caco2細(xì)胞,再與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的ANXA2敲除caco2細(xì)胞系共同作為研究對象,進(jìn)一步了解ANXA2與tPA兩個(gè)腫瘤相關(guān)基因在結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞中的相互作用及可能的作用機(jī)制,以深入探索ANXA2與tPA在人結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展中的作用,從而為結(jié)直腸癌的早期診斷和治療提供更為詳實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為結(jié)直腸癌防治和預(yù)后評(píng)估提供新的思路。方法1.ANXA2基因敲除caco2細(xì)胞系(ANXA2-/-ca.co2)的構(gòu)建與鑒定(Western blot)。2.檢測細(xì)胞活性,并分析ANXA2在不同時(shí)間點(diǎn)對caco2細(xì)胞增殖能力的影響(MTT法、倒置熒光顯微成像系統(tǒng))。3.檢測ANXA2在不同時(shí)間點(diǎn)對caco2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響(損傷修復(fù)法、Transwell小室實(shí)驗(yàn))。4.檢測ANXA2基因敲除后對結(jié)直腸癌細(xì)胞蛋白組的影響(蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜分析法、生物信息學(xué)分析)。5.tPA基因敲除caco2細(xì)胞系的構(gòu)建(TALEN技術(shù))。結(jié)果1. Western blot方法鑒定結(jié)果顯示ANXA2基因敲除caco2細(xì)胞系(ANXAT2-/-caco2)構(gòu)建成功。2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA2基因的敲除導(dǎo)致caco2細(xì)胞的增殖能力受到明顯的抑制(**P0.01)。3.損傷修復(fù)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA2基因敲除的caco2細(xì)胞遷移能力明顯下降,特別是48h后對細(xì)胞遷移能力抑制更為顯著(*P0.05)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣說明ANXA2有助于強(qiáng)化caco2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(**P0.01)。4.蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果顯示ANXA2基因敲除caco2細(xì)胞(KO)和野生型caco2細(xì)胞(WT)兩組共有40個(gè)差異蛋白點(diǎn),選擇其中凝膠上所匹配蛋白點(diǎn)表達(dá)量的比值大于2,在同組三塊平行凝膠圖譜中都出現(xiàn)相同變化的15個(gè)差異蛋白點(diǎn)作為質(zhì)譜分析的對象。與WT組相比,KO組中有11個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。將15個(gè)差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析指紋圖案與NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(2015年1月更新)進(jìn)行比對分析后,結(jié)果顯示這15個(gè)蛋白分別是actin cytoplasmic 1 (ACTB)、actinin alpha 4 (ACTN4)、keratin type I cytoskeletal 10(KRT10;KBiP protein (HSPA5)、alpha-tubulin (a-tubulin)、mitochondrial heat shock 60kD protein 1 variant 1 (HSPD1)、thyroid hormone binding protein precursor (p55)、mitochondrial ATP synthase H+ transporting F1 complex beta subunit (ATP5B)、Human Enolase 1 (Henol)、Keratin 18 (KRT18)、Keratin 19 (KRT19)、cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)、 alpha-tubulin (a-tubulin)、protein disulfide isomerase-related protein 5 (PDIA 5)、keratin 1 (KRT1)等,其中ANXA2基因敲除后共有11個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào),4個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)。5.以轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcriptional activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)對tPA基因進(jìn)行敲除的實(shí)驗(yàn)中,共獲得10個(gè)細(xì)胞單克隆,測序分析比對結(jié)果顯示所有單克隆均沒有發(fā)生基因組序列突變,顯示這十個(gè)細(xì)胞單克隆中沒有tPA基因敲除成功的陽性克隆。經(jīng)與國內(nèi)同行溝通以及本室其他同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,本次實(shí)驗(yàn)努力至少說明說明本研究所使用的從上海斯丹賽公司購買的TALEN試劑盒不易于對靶基因成功進(jìn)行敲除。結(jié)論結(jié)果顯示ANXA2基因與人結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞的生長、增殖及運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。敲除ANXA2基因的表達(dá)可抑制caco2細(xì)胞的體外增殖力和遷移侵襲能力，提示ANXA2具有成為結(jié)腸癌基因治療或藥物治療新靶點(diǎn)的潛在性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的蛋白組學(xué)初步研究結(jié)果揭示結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞中潛在的蛋白組學(xué)特點(diǎn),為結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展過程中的蛋白相互作用機(jī)制的進(jìn)一步探索以及相關(guān)基因功能的研究提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為ANXA2在CRC時(shí)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)研究奠定了一定基礎(chǔ)。利用從上海斯丹賽公司購買的TALEN試劑盒構(gòu)建tPA基因敲除結(jié)直腸癌caco2細(xì)胞系未獲得成功,說明該試劑盒不易對靶基因敲除成功,后續(xù)研究還需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和條件。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王有良;朱一劍;丁顯平;;L1、E6和E7基因序列分析[J];成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年03期

2 江金群;張玉心;徐成嶺;胡建國;馬杰;石瑩;;Hes1基因啟動(dòng)子的克隆及活性研究[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年09期

3 Jin-Feng Wang;Chao Liu;Qu Zhang;Guan-Hong Huang;;Research progress in the radioprotective effect of the canonical Wnt pathway[J];Cancer Biology & Medicine;2013年02期

4 葛亮;吳先志;鄧超雄;;T管造瘺在晚期宮頸癌患者輸尿管支架置入中的應(yīng)用[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年12期

5 齊平;靳穎華;張為革;宋宏銳;;分子靶點(diǎn)抗腫瘤藥物研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)藥導(dǎo)刊;2014年02期

6 馬月;王保國;曹奕;;針灸對缺血性腦卒中血管新生的影響[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2014年04期

7 吳軍;黃群;梁慶祖;盧冬;黃勇平;黃華武;韋高猛;黃敏玉;;血清VEGF在腎癌不同分期分級(jí)中的表達(dá)及其意義[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2014年06期

8 魏葆s，

本文編號(hào)：1244526