發(fā)布時間：2017-12-02 07:03

  本文關(guān)鍵詞：ApoG2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的實驗研究

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【摘要】：研究背景：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,2014年美國女性惡性腫瘤發(fā)病率中29%為乳腺癌,高居榜首,而女性惡性腫瘤病死率中15%為乳腺癌,僅次于肺癌。中國抗癌協(xié)會公布的統(tǒng)計表明我國近年來乳腺癌的發(fā)病率亦呈逐年上升態(tài)勢,占女性惡性腫瘤發(fā)病率中的第1位,死亡率的第4位。同時,患者發(fā)病年齡漸趨年輕化。針對乳腺癌的各種研究層出不窮,治療方案也在不斷推陳出新,但對于中晚期乳腺癌患者,規(guī)范治療中以及治療完成后出現(xiàn)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療過程中的難點和熱點,因此進(jìn)一步尋找控制乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的方法迫在眉睫。近年來,針對乳腺癌的基礎(chǔ)研究以及診斷、治療方案都取得了很大的進(jìn)展,乳腺癌應(yīng)視為一全身性疾病并給予綜合治療的觀點逐漸得到業(yè)內(nèi)人士的廣泛認(rèn)同。當(dāng)前乳腺癌治療手段可分為手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療。根據(jù)患者腫瘤的生物學(xué)行為,以及患者身體基礎(chǔ)情況,綜合運(yùn)用以上諸種治療方案,針對腫瘤局部及全身進(jìn)行治療,可顯著提高患者質(zhì)量,延長患者生存期。在中晚期乳腺癌綜合治療中,化療是其中至關(guān)重要的一環(huán)。中晚期乳腺癌患者化療目的主要為控制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,提高患者生活質(zhì)量,延長患者生存時間。然而在治療患者的同時,化療也存在不可忽視的副作用。乳腺癌化療常用的CAF、TAC、CMF等方案可導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心嘔吐、骨髓抑制、神經(jīng)損害、免疫功能紊亂、皮膚黏膜損害等副作用,進(jìn)而使患者無法耐受,影響化療效果。如果可以找到適當(dāng)?shù)乃幬?可以在殺滅乳腺腫瘤細(xì)胞的同時,減輕對正常組織的副作用,是當(dāng)前廣大患者和醫(yī)務(wù)工作者的迫切需求。棉酚(gossypol)是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物,主要存在于錦葵植物棉花的根、莖、葉和種子內(nèi),在棉籽仁中含量最高。具有抑制精子發(fā)生和精子活動的作用。我國曾將其作為一種有效的男用避孕藥。自60年代初至今,已有多項體內(nèi)外實驗表明,棉酚可以抑制多種腫瘤的生長,具有一定的抗腫瘤作用。棉酚主要有兩種異構(gòu)體,右旋棉酚和左旋棉酚,其中主要有效成分為左旋棉酚,可阻斷Bc-2家族中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等與促凋亡蛋白Bax、 Bad等結(jié)合形成二聚體,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但左旋棉酚仍有一定的副作用,其分子結(jié)構(gòu)兩端各存在一個醛基,存在一定的毒性,其潛在副作用限制了左旋棉酚在抗腫瘤作用中的最大劑量。在這樣的背景下,針對左旋棉酚進(jìn)一步研究,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,合成了Apogossypolone,簡稱ApoG2,其在左旋棉酚基礎(chǔ)上去掉了兩端的醛基,同時保留了抗腫瘤主要結(jié)構(gòu)。其較左旋棉酚毒性小,副作用明顯小于前者,抗腫瘤效果好,在腫瘤治療方面有著更好的前景。本研究以高表達(dá)Bcl-2基因的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR細(xì)胞為研究對象,重點研究ApoG2對上述3種乳腺癌細(xì)胞系的增殖抑制及誘導(dǎo)其凋亡的作用,同時對其中的乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)進(jìn)行了初步的研究。研究目的：本實驗選取高表達(dá)Bcl-2的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR作為研究對象,研究ApoG2對上述三種細(xì)胞系的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作并探討可能的作用機(jī)制,同時進(jìn)一步研究了ApoG2對乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。方法：1.采用CCK8體外增殖法研究ApoG2在0μmol/L、10 μmol/L、20 40 μmol/L和80 μmol/L的濃度下作用24h、48h、72h后,對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的體外增殖抑制作用；2. Hoechst 33342及PI雙重?zé)晒馊旧ㄓ^察20μ mol/L和40μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后引起的凋亡形態(tài)學(xué)變化；3.使用平板克隆實驗檢測5μmol/L、10μmol/L以及20μmol/L濃度的ApoG2持續(xù)作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 14d后細(xì)胞增殖能力的變化；4.使用Annexin V/FITC雙染試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測20 μmol/L和40 μmol/L ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后引起的細(xì)胞凋亡率變化情況；5.使用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測20 μmol/L和40 μ mol/L ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后引起的細(xì)胞線粒體活性變化情況；6.使用PI染色法,通過流式細(xì)胞儀檢測20 μ mol/L和40 μ mol/L ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR后引起的細(xì)胞周期變化情況；7.使用劃痕實驗檢測經(jīng)5 μ mol/L以及10 μmol/L濃度的ApoG2作用于人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR后12h、24h細(xì)胞遷移能力的變化使用Western Blotting法檢測經(jīng)20 μ mol/L以及40 μ mol/L ApoG2分別處理24h及48h后的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)變化以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR中MDR1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：1.通過CCK8體外增殖實驗檢測提示,所選取的不同濃度的ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR,組間結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),相同藥物濃度分別作用24h、48h、72h后,對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR亦具有不同程度的增殖抑制作用(P0.05),作用效果隨藥物濃度或時間延長,增殖抑制作用逐漸加強(qiáng),呈劑量-時間依賴性。同時可以發(fā)現(xiàn)藥物濃度以及作用時間二者存在交互效應(yīng),藥物濃度越高、作用時間越長,對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng)(P0.05)。2.使用Hoechst 33342及PI雙重染色法觀察20μmol/L和40μmol/L的ApoG2作用48h后的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR后,于熒光顯微鏡下觀察,可見陰性對照組細(xì)胞呈均勻淡藍(lán)色；凋亡細(xì)胞細(xì)胞呈明亮藍(lán)色及偏暗紅色重疊后的淡紫色,并出現(xiàn)凋亡經(jīng)典的核固縮、核碎裂、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡現(xiàn)象；壞死細(xì)胞呈明亮藍(lán)色及明亮紅色重疊后的亮紫色。隨劑量增高,凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞逐漸增多。3.使用平板克隆實驗檢測5μmol/L、10 μmol/L以及20 μmol/L濃度的ApoG2持續(xù)作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR后14d,細(xì)胞克隆形成能力較陰性對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示低濃度ApoG2即可降低上述細(xì)胞系克隆形成能力。4.使用Annexin V/FITC雙染試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測20 μmol/L和40 μmol/L ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后,各處理組之間細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),隨藥物濃度增加,凋亡率明顯提高,提示ApoG2作用后可使上述細(xì)胞系系發(fā)生凋亡。5.使用JC-1染色線粒體膜電位檢測試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測20 umol/L和40 μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后,各處理組之間細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的下降,且線粒體膜電位下降情況呈濃度相關(guān)性,提示ApoG2可使上述細(xì)胞系系細(xì)胞線粒體膜活性下降,線粒體損傷。6.使用PI染色法,通過流式細(xì)胞儀檢測20 μ mol/L和40 μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 48h后,相較于陰性對照組,不同ApoG2藥物處理組細(xì)胞被阻滯后G2期的比例明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),同時伴有不同程度G1/S期細(xì)胞比例增加,提示我們ApoG2可以引起上述腫瘤細(xì)胞系發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。7.使用劃痕實驗檢測5μ mol/L以及10μmol/L濃度的ApoG2作用于人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR 12h以及24h后,細(xì)胞遷移能力使得劃痕變窄,結(jié)果顯示上述ApoG2處理組較陰性對照組,劃痕恢復(fù)速度明顯弱于對照組,提示低濃度ApoG2可以抑制MCF-7/ADR的細(xì)胞細(xì)胞遷移能力。8.使用Western Blotting法檢測經(jīng)20 μ mol/L以及40 μ mol/L ApoG2分別處理24h及48h人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7. MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR后,上述分組中Bcl-2蛋白表達(dá)較對照組降低(P0.05), Bax蛋白表達(dá)較對照組升高(P0.05)。3種細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)表達(dá)較對照組升高(P0.05)。提示ApoG2處理48h后,上述3種細(xì)胞株出現(xiàn)凋亡。經(jīng)20μmol/L以及40μ mol/L ApoG2分別處理24h及48h處理后的人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR,其MDR1蛋白表達(dá)較對照組降低(P0.05),提示ApoG2可使得MCF-7/ADR的耐藥情況發(fā)生變化。9.結(jié)論：ApoG2可以明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR的增殖能力,降低MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移能力,誘導(dǎo)上述細(xì)胞系發(fā)生凋亡。其機(jī)制與Bcl-2家族蛋白表達(dá)改變及線粒體膜電位發(fā)生改變相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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3 牛曉閣;汪森明;;棉酚及其衍生物——ApoG2抗腫瘤研究進(jìn)展[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2010年22期

4 陳要臻;陳晨;黃曉鋒;穆士杰;胡興斌;安群星;張獻(xiàn)清;;Apogossypolone對人前列腺癌LNCaP移植瘤的生長抑制作用[J];腫瘤預(yù)防與治療;2011年03期

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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5 廖曉莉;ApoG2增強(qiáng)放射線誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞自噬性死亡及其分子機(jī)制[D];暨南大學(xué);2010年

6 陳文飛;醋酸棉酚對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞MGMT和hMLH1基因蛋白及mRNA表達(dá)的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

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8 鐘梅;Apogossypolone聯(lián)合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞體內(nèi)外的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號：1244022