本文關(guān)鍵詞：APE1在乳腺癌中的表達(dá)及其對Olaparib藥物敏感性的影響

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【摘要】：第一部分乳腺癌組織中APE1表達(dá)及臨床意義目的:三陰性乳腺癌特征是免疫組化結(jié)果顯示HER2/ER/PR均為陰性,這種類型的乳腺癌預(yù)后較差,生物學(xué)行為特殊且缺少內(nèi)分泌治療和靶向治療的有效靶點(diǎn),是制約乳腺癌臨床治療發(fā)展的瓶頸。近15%的三陰性乳腺癌患者存在DNA損傷修復(fù)基因的致病性突變,提示三陰性乳腺癌存在著與其他分子類型不同的克隆起源。在DNA堿基損傷修復(fù)中,APE1是其中的關(guān)鍵限速酶。在本研究中,檢測APE1在乳腺癌中的表達(dá),分析其與乳腺癌的臨床病理特征的關(guān)系,及APE1對三陰性乳腺癌患者預(yù)后的影響。方法:采用免疫組化Envision兩步法檢測323例乳腺癌中APE1蛋白的表達(dá),其中三陰性乳腺癌為108例。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行。采用卡方檢驗、Fisher精確檢驗法針對計數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計。生存分析采用Kaplan-Meier法。兩組生存率的比較采用log rank檢驗進(jìn)行。多因素分析使用Cox回歸模型。所有統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行三次以上驗證,并以P0.05定義為具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:APE1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(其中非三陰組99.3%Vs 0.7%,P0.0001;三陰組85.6%Vs 14.4%,P0.0001)。其表達(dá)與腫瘤大小,人類表皮生長因子2型受體,腋窩淋巴結(jié)狀態(tài),雌激素受體,臨床分期密切相關(guān)(P0.05)。即便在預(yù)后相對不佳的腋窩淋巴結(jié)陽性組,APE1低表達(dá)也顯示比APE1高表達(dá)組有更高的生存率(P=0.0427)。結(jié)論:APE1在乳腺癌組織中明顯高于癌旁組織,提示可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。COX結(jié)果提示其高表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后不佳的獨(dú)立因子,可能成為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。第二部分三陰性乳腺癌中APE1對O1aparib(PARP1抑制劑)敏感性影響目的:PARP-1是DNA單鏈修復(fù)的重要基因,APE1也參與DNA單鏈損傷修復(fù)。BRCA1是DNA雙鏈損傷修復(fù)的重要修復(fù)酶。當(dāng)BRCA1缺陷且抑制PARP1功能時易產(chǎn)生聯(lián)合致死效果。但PARP1抑制劑的臨床研究并未顯示出在BRCA1突變的乳腺癌中有顯著的"高效",其原因不清。由于APE1與PARP1在DNA堿基切除修復(fù)通路中的作用相似,之間的關(guān)系尚不明確。是否二者之間存在相互競爭,從而影響PARP1抑制劑的療效,有待于研究。因此,本實驗構(gòu)建了 BRCA1缺陷的三陰性乳腺癌HCC1937的APE1敲除株,觀察PARP1抑制劑作用于敲除株和野生株后對細(xì)胞株增殖及凋亡的影響,明確PARP1與APE1的關(guān)系。方法:通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立APE1敲除的HCC1937細(xì)胞穩(wěn)定株。蛋白免疫印跡實驗檢測加入PARP-1抑制劑Olaparib前后野生型HCC1937細(xì)胞的APE1表達(dá),以及APE1敲除株和野生型HCC1937中PARP1的表達(dá)。通過CCK8實驗測量APE1敲除株和野生型HCC1937加入Olaparib后的IC50值和生長曲線。使用流失細(xì)胞儀檢測經(jīng)過Olaparib處理后的APE1敲除株和野生型HCC1937的周期和凋亡情況。結(jié)果:使用不同濃度PARP-1抑制劑Olaparib處理野生型HCC1937發(fā)現(xiàn),當(dāng)Olaparib為10μM時,APE1表達(dá)降低;當(dāng)增加Olaparib的濃度為15μM時,APE1表達(dá)降低更加顯著。在APE1敲除株HCC1937-APE1-KO中,內(nèi)源性PARP1表達(dá)也比野生型HCC1937減少。使用CCK8測量,與HCC1937相比,HCC1937-APE1-KO的IC50明顯增加。生長曲線表明,使用PARP1抑制劑第五天時,野生型和APE1敲除株的抑制率分別為68%和27%,說明PARP1抑制劑對野生型HCC1937殺傷力更強(qiáng)。使用流式細(xì)胞術(shù)測量后發(fā)現(xiàn),HCC1937經(jīng)過Olaparib 40μM處理后引起更明顯的有絲分裂G2/M阻滯,而HCC1937-APE1-KO周期未有明顯變化;且HCC1937比HCC1937-APE1-KO的凋亡率顯著增加。結(jié)論:使用PARP1抑制劑作用于HCC1937野生型細(xì)胞殺傷效果更強(qiáng),而敲除APE1可能產(chǎn)生耐藥。說明APE1表達(dá)是PARP1維持功能的重要基礎(chǔ),APE1的缺失可能與PARP1抑制劑的耐藥相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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