本文關(guān)鍵詞：RNAi沉默RPL34基因?qū)θ宋赴㏒GC-7901細(xì)胞增殖和周期的影響

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【摘要】：目的:胃癌是最常見的消化道腫瘤之一,胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、涉及多個(gè)基因參與的復(fù)雜過程。RPL34基因被認(rèn)為在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等多個(gè)生物學(xué)途徑。本研究通過構(gòu)建RPL34特異性si RNA慢病毒載體,感染胃癌SGC-7901細(xì)胞,設(shè)置陰性對(duì)照組和干擾組,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)兩組細(xì)胞干擾的效果,MTT法檢測(cè)RPL34在RNAi作用下的細(xì)胞增殖率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。通過本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究RPL34基因應(yīng)用于腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ),為胃癌的治療提供新的策略。方法:1.重組慢病毒感染胃癌SGC-7901細(xì)胞將胃癌SGC-7901細(xì)胞分為兩組,實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染RPL34-si RNA慢病毒載體和si RNA陰性對(duì)照慢病毒載體。感染前將胃癌細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)24h后,加入慢病毒濃縮液20ul進(jìn)行感染,72h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況,計(jì)算感染效率。2.Real-time PCR檢測(cè)RNAi對(duì)目的基因的干擾效果Trizol法抽提細(xì)胞RNA,采用Oligo(d T)引物和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以各組細(xì)胞c DNA作為模板,每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行Real-time定量PCR檢測(cè)。3.MTT法檢測(cè)RPL34基因在RNAi作用下的細(xì)胞增殖率取2組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板,每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔,分別在接種后1、2、3、4和5d每孔加入濃度為5g/L MTT溶液10ul,培養(yǎng)4h后棄去上清,每孔加入DMSO100ul,震蕩溶解后,使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值,記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期胰酶消化經(jīng)慢病毒感染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,使細(xì)胞完全分散為單個(gè)細(xì)胞,然后用預(yù)冷的PBS液洗滌3次,15000rpm離心10min后收集細(xì)胞,棄去上清,加入1ml預(yù)冷PBS液重懸細(xì)胞,加入PI(1:100)及RNase(1:100)避光冰浴10min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果:濃縮后的重組慢病毒感染人胃癌SGC-7901細(xì)胞,48h后在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度高,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,表明慢病毒已穩(wěn)定感染胃癌細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組RPL34表達(dá)水平明顯受到抑制(P0.05),提示RPL34-si RNA能有效沉默胃癌SGC-7901細(xì)胞的RPL34基因。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照組總體生長(zhǎng)速度降低(P0.05),提示靶向抑制RPL34基因表達(dá)后可顯著降低胃癌細(xì)胞的增殖活力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞明顯減少(P0.05),而G2/M期細(xì)胞增加(P0.05),說明RPL34基因表達(dá)下調(diào)后,細(xì)胞有絲分裂明顯減緩,細(xì)胞增殖受到明顯抑制,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1.慢病毒介導(dǎo)的RNAi能穩(wěn)定有效地下調(diào)RPL34基因的表達(dá)。2.抑制RPL34基因的表達(dá)后,胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和有絲分裂明顯減緩。3.RPL34基因在維持胃癌細(xì)胞生物學(xué)方面發(fā)揮重要作用,可能為胃癌的基因靶向治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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3 石s，

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