發(fā)布時(shí)間：2017-11-27 17:25

  本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍通過激活Hippo信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞生長的作用研究

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【摘要】：【研究背景及目的】胰腺癌(Pancreatic Cancer,PCa),是惡性程度最高的腫瘤之一,近年來發(fā)病率和死亡率逐漸升高。目前,手術(shù)切除是治療該病的最佳途徑。由于起病隱匿,進(jìn)展快,易轉(zhuǎn)移,多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)失了手術(shù)良機(jī)。此外,胰腺癌分化程度低,對(duì)放、化療的敏感性差。胰腺癌患者5年生存率約為4%,預(yù)后極差。胰腺癌的高度惡性、高病死率、治療效果差,使其成為世界難題,引起人們的廣泛關(guān)注。因此,探尋胰腺癌的特異性診斷方法和新的治療靶點(diǎn)是目前迫切需要解決的問題。二甲雙胍是臨床上治療2型糖尿病的常用藥物之一。除了抑制肝臟葡萄糖輸出、促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的利用之外,二甲雙胍還能改善胰島素抵抗,降低甘油三酯和膽固醇水平,改善肥胖狀態(tài)。近年來,多項(xiàng)臨床研究表明,與服用其他降糖藥物和注射胰島素的2型糖尿患者相比,長期服用二甲雙胍的患者發(fā)生胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低。體外實(shí)驗(yàn)也紛紛證實(shí),二甲雙胍可顯著抑制Aspc-1,Panc-1,Sw1990等多種胰腺癌細(xì)胞株的惡性生物學(xué)行為,大劑量甚至有殺滅作用。有學(xué)者認(rèn)為二甲雙胍抑制胰腺癌生長的一部分原因是其降低了循環(huán)胰島素水平,阻礙了胰島素/胰島素樣生長因子-1(inslin-like growth factor-1,IGF-1)軸的促腫瘤作用。近來一些研究表明,二甲雙胍誘導(dǎo)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化,繼而抑制或激活一些促癌或抑癌基因而發(fā)揮作用。目前,二甲雙胍抑制胰腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)理尚未完全闡明,仍需我們進(jìn)一步深入研究。本研究用二甲雙胍處理胰腺癌細(xì)胞后,采用多種細(xì)胞和分子生物學(xué)方法驗(yàn)證二甲雙胍對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、凋亡水平以及遷移和侵襲能力的影響。然后利用基因芯片技術(shù)篩選與二甲雙胍抑制胰腺癌作用相關(guān)的基因,分析其可能涉及的信號(hào)通路,并進(jìn)一步探究二甲雙胍對(duì)上述通路的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)我們前期的工作基礎(chǔ),免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hippo通路核心蛋白MST1在胰腺癌和癌旁均為陰性;YAP在胰腺癌組織表達(dá)呈強(qiáng)陽性,而在癌旁組織中表達(dá)呈弱陽性,表明Hippo通路YAP活化參與胰腺癌的發(fā)生(此為同課題組高軍教授的實(shí)驗(yàn)成果)。Hippo信號(hào)通路是一條抑制細(xì)胞生長的通路,主要介導(dǎo)細(xì)胞間的接觸抑制,對(duì)維持器官大小及細(xì)胞增殖和凋亡的平衡都發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。我們以此推測(cè),二甲雙胍抑制胰腺癌的作用可能與Hippo通路相關(guān)。為了證實(shí)上述推測(cè),我們重點(diǎn)關(guān)注Hippo信號(hào)通路因子在基因芯片上的表達(dá)情況,并初步探索二甲雙胍抑癌效應(yīng)與Hippo信號(hào)通路的關(guān)系�！緦�(shí)驗(yàn)方法】1.體外培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1,用5,10,15,20,40mmol/L的二甲雙胍分別處理細(xì)胞24h,48h,60h,72h,同時(shí)以不加藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。采用CCK-8法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)細(xì)胞增殖力的影響。并根據(jù)細(xì)胞抑制率獲取半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration,IC50)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究。2.用IC50濃度的二甲雙胍處理PANC-1細(xì)胞48h,同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不加二甲雙胍處理),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。3.實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同上,采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PANC-1細(xì)胞遷移能力的變化。4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PANC-1細(xì)胞的體外侵襲能力。5.利用基因芯片技術(shù)篩選出與二甲雙胍抑制胰腺癌作用相關(guān)的基因,并分析其可能涉及的信號(hào)通路。6.分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)上述信號(hào)通路的影響。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.二甲雙胍能顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力,并呈劑量依賴性。二甲雙胍抑制PANC-1細(xì)胞增殖的IC50值約為20mmol/L,故選取20mmol/L二甲雙胍處理細(xì)胞48h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.PANC-1細(xì)胞經(jīng)20mmol/L二甲雙胍處理48h后,細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,S期縮短,且細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。3.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組細(xì)胞在劃痕處愈合較快,48h后劃痕基本完全愈合,而處理組細(xì)胞劃痕愈合較慢,表明二甲雙胍能抑制PANC-1細(xì)胞的遷移能力。4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于二甲雙胍處理組,這表明二甲雙胍可顯著抑制PANC-1細(xì)胞的體外侵襲能力。5.基因芯片結(jié)果示:處理組與對(duì)照組相比,Hippo信號(hào)通路因子YAP1、MST1、TEAD3表達(dá)差異顯著。6.二甲雙胍處理后,PANC-1細(xì)胞中Hippo信號(hào)通路因子MST1、LATS1、YAP1m RNA的相對(duì)表達(dá)量均升高;MST1、LATS1及磷酸化YAP1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,而YAP1總體表達(dá)水平無明顯差異�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)論】二甲雙胍可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖、遷移及侵襲能力,并影響其細(xì)胞周期,促進(jìn)凋亡。二甲雙胍對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長抑制作用主要通過抑制增殖、促進(jìn)凋亡和阻滯細(xì)胞周期發(fā)揮。二甲雙胍可以通過激活Hippo信號(hào)通路,使致癌因子YAP磷酸化失活,不能有效入核及啟動(dòng)其下游促癌靶基因表達(dá),從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：1232633