本文關(guān)鍵詞：Anti-cMet抗體耦合空心納米金球?qū)m頸癌光熱治療增敏之作用研究

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【摘要】：研究背景宮頸癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在發(fā)展中國(guó)家,宮頸癌仍是腫瘤主要的死亡原因。放射治療在宮頸癌治療中占有重要地位,但其副作用及放療抵抗是臨床上需要解決的問(wèn)題。光熱治療是在激光照射的基礎(chǔ)上,利用光熱轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的高熱量消除腫瘤細(xì)胞,以其全身副作用少和不易引起治療抵抗等特點(diǎn)正成為腫瘤治療新方法的研究熱點(diǎn)。cMet,也被稱作肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR),過(guò)表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞的表面,并與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及抗凋亡有關(guān)。本論文主要通過(guò)合成具有特殊結(jié)構(gòu)的空心納米金球并偶聯(lián)抗cMet單克隆抗體以構(gòu)建生物相容性較好的靶向腫瘤細(xì)胞的生物探針,得到的靶向抗體金球在光熱治療所用的激光波長(zhǎng)處具有明顯的紅外吸收峰,使得在較低能量的激光照射下即可達(dá)到靶向消融宮頸癌細(xì)胞的目的,從而提高光熱治療的治療效應(yīng)。研究目的討論靶向抗體金球在腫瘤光熱治療增敏方面的作用,并初步探討其對(duì)光熱治療增敏作用的生物學(xué)機(jī)制。研究方法利用金置換銀的方法合成大小、形狀均一的中空納米金球(HGNs),利用帶有異官能團(tuán)的聚乙二醇復(fù)合物(SH-PEG-COOH)作為連接劑,聚乙二醇復(fù)合物的巰基末端與空心納米金球表面的金原子形成穩(wěn)定的Au-S連接,聚乙二醇復(fù)合物的羧基末端與抗cMet單克隆抗體的氨基末端形成酰胺鍵,從而合成穩(wěn)定的、分散性良好的具有靶向功能的抗體納米金球(anti-cMet/HGNs)。利用高分辨率透射電子顯微鏡(TEM)和紫外-可見(jiàn)-近紅外光譜等對(duì)納米金球進(jìn)行表征。選擇人子宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa和人子宮頸鱗癌細(xì)胞系CaSki兩種細(xì)胞系作為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)研究光熱作用對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。應(yīng)用免疫熒光對(duì)兩種細(xì)胞系進(jìn)行染色并使用共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種宮頸癌細(xì)胞表面肝細(xì)胞因子受體-cMet的表達(dá)情況。應(yīng)用CCK-8方法通過(guò)檢測(cè)不同濃度HGNs和anti-cMet/HGNs對(duì)細(xì)胞抑制率的影響,研究它們對(duì)兩種細(xì)胞的毒性作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選出細(xì)胞相容性良好的納米金工作濃度即為安全的生物濃度,在此藥物濃度下進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)統(tǒng)計(jì)兩種細(xì)胞系對(duì)HGNs和anti-cMet/HGNs的攝取情況。兩種細(xì)胞系分別分為四組：對(duì)照組,NIR照射組,HGNs+NIR照射組以及anti-cMet/HGNs+NIR照射組。宮頸癌細(xì)胞攝取納米金球后,應(yīng)用與抗體金球等離子共振吸收峰相近的NIR(808nm)激光照射,照射能量采用1.7J/cm2,近紅外光光斑面積為1cm×2cm,照射時(shí)間為10分鐘。使用CCK-8法應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450nnm處的吸光度值以評(píng)價(jià)納米金球?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能后殺傷腫瘤細(xì)胞的效能。將各組細(xì)胞用FITC Annexin V和PI雙染后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。利用Western Blot測(cè)定各組細(xì)胞對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：所制備的平均粒徑67.35nm平均壁厚7.25nm的空心納米金球規(guī)格均一,等離子共振吸收峰在788nm左右。經(jīng)聚乙二醇復(fù)合物修飾的空心納米金球結(jié)合抗cMet單克隆抗體后得到靶向抗體金球(anti-cMet/HGNs),其等離子共振吸收峰發(fā)生了約20nm的輕度右移。HeLa和CaSki兩種細(xì)胞系均可在細(xì)胞膜觀察到cMet的高表達(dá)。經(jīng)聚乙二醇復(fù)合物修飾后的抗體金球與空心納米金球相比,其細(xì)胞毒性明顯降低。空心納米金球?qū)eLa的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.1nmol/L,對(duì)CaSki的IC50為0.6mnol/L。ICP-AES結(jié)果顯示兩種細(xì)胞系對(duì)靶向抗體金球的攝取量均明顯高于對(duì)空心納米金球的攝取量。納米金球分別與兩種細(xì)胞共孵育24小時(shí),接受NIR激光照射后,CCK-8法測(cè)得抗體金球+NIR照射組的細(xì)胞抑制率分別為34.8%(HeLa)和53.6%(CaSki),其余三組未見(jiàn)明顯的細(xì)胞死亡,差異具有顯著性(P0.05)。流式細(xì)胞儀測(cè)得接受激光照射的抗體金球組的細(xì)胞凋亡率分別為8.54%(HeLa)和31.6%(CaSki)。接受激光照射后,攝取納米金球組中Bax, Caspase-3和Cyclin E2在兩種細(xì)胞系的表達(dá)量均高于對(duì)照組,而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量則與之相反。其中,抗體金球組比裸金組以及單純光熱治療組趨勢(shì)更明顯。結(jié)論Anti-cMet單克隆抗體耦合空心納米金球?qū)m頸癌的光熱治療具有增敏作用,可能通過(guò)破壞Bcl-2與Bax之間的平衡并激活Fas通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33

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