本文關(guān)鍵詞：miRNA對(duì)Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控作用及機(jī)制研究

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【摘要】：惡性腫瘤是一種發(fā)病率和致死率都非常高的疾病,其發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。Cripto-1蛋白又稱為畸胎瘤衍生生長(zhǎng)因子-1(Teratocarcinoma-derived growth factor 1,TDGF-1),是表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)/Cripto-1-FRL-1-Cryptic(CFC)家族的一員。已有研究證明,Cripto-1主要在胚胎發(fā)育的早期階段表達(dá),在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá),而在惡性腫瘤中又重新表達(dá),并能促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管的發(fā)生。這表明Cripto-1是一個(gè)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的癌基因,因此深入研究Cripto-1蛋白的表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制具有重要意義。miRNA是一種非編碼RNA,可以與靶基因mRNA 3'UTR特異性結(jié)合,通過(guò)抑制翻譯或者使mRNA降解導(dǎo)致基因沉默,在癌基因表達(dá)調(diào)控和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著不容忽視的作用,但是miRNA是否也參與了Cripto-1蛋白的表達(dá)調(diào)控尚不清楚。在本研究中,我們利用TargetScan、PicTar、miRBase Targets生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Cripto-1 mRNA 3'UTR上潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法篩選出調(diào)控Cripto-1 mRNA 3'UTR活性的miRNA,并初步探討了miRNA對(duì)Cripto-1促腫瘤作用的調(diào)控作用及機(jī)制,得到以下結(jié)果。1.靶向Cripto-1 mRNA 3'UTR的mi RNA的預(yù)測(cè)及鑒定。我們利用生物信息學(xué)軟件和Cripto-1 mRNA 3'UTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因法篩選出調(diào)控Cripto-1表達(dá)的三種miRNA,分別是miR-1285-5p、miR-4776-3p和mi R-3929。隨后我們利用qRT-PCR、western blot法分別從mRNA水平和蛋白水平上證實(shí)了這三種mi RNA對(duì)Cripto-1表達(dá)的抑制作用。之后我們還進(jìn)行了miRNA靶向Cripto-1的反向驗(yàn)證。將這三種miRNA及Cripto-1表達(dá)載體(不包含3'UTR區(qū))同時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)的Cripto-1蛋白并未受miRNA的影響。此結(jié)果進(jìn)一步證明了這三種miRNA通過(guò)與Cripto-1 mRNA 3'UTR相互作用來(lái)調(diào)控其表達(dá)。2.miRNA對(duì)Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的影響。為了檢測(cè)這三種miRNA的生物學(xué)活性,我們首先利用MTT法檢測(cè)了它們對(duì)Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示,miR-1285-5p、mi R-4776-3p、miR-3929對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa的活力具有抑制作用。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和Ki67免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示,miR-1285-5p、miR-4776-3p、miR-3929能夠抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖。Boyden小室實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-1285-5p、miR-4776-3p、mi R-3929對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa的侵襲、遷移能力具有抑制作用。3.miRNA調(diào)控Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制研究。DAPI染色及Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,這三種miRNA可誘導(dǎo)Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步的免疫印跡分析結(jié)果顯示,這三種miRNA可以增加cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平,同時(shí)可下調(diào)Bcl-2/Bax的表達(dá)比率,提示這三種miRNA可通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),這三種miRNA可使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,進(jìn)而抑制HeLa細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的免疫印跡分析結(jié)果表明,這三種miRNA可上調(diào)HeLa細(xì)胞中CDK2、p27蛋白的表達(dá),同時(shí)下調(diào)cyclin E的表達(dá)。為了研究miRNA抑制細(xì)胞遷移及侵襲的機(jī)制,我們利用免疫印跡法檢測(cè)了這三種miRNA對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,這三種miRNA均可以促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá),而抑制N-cadherin、Vimentin和MMP9的表達(dá),提示這三種miRNA可以影響HeLa細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。綜上所述,本研究初步探討了miRNA對(duì)Cripto-1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控作用及機(jī)制,從而為以Cripto-1為靶點(diǎn)的腫瘤診斷和治療奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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