本文關(guān)鍵詞：粒細(xì)胞集落刺激因子通過促進(jìn)腎臟分泌EPO刺激小鼠脾紅細(xì)胞生成作用的研究

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【摘要】：[研究背景]粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子,能促進(jìn)粒細(xì)胞生成和增強(qiáng)粒細(xì)胞活性,臨床上用于治療各種原因引起的粒細(xì)胞減少癥和動(dòng)員造血干/祖細(xì)胞用于造血干/祖細(xì)胞移植。近期有文獻(xiàn)研究提示G-CSF可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和加重腫瘤患者貧血癥狀；G-CSF動(dòng)員造血干細(xì)胞之后,會(huì)造成健康捐獻(xiàn)者造血干細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間基因表達(dá)異常；長(zhǎng)時(shí)間使用G-CSF治療先天性粒細(xì)胞減少癥可增加患白血病的概率；而我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),分泌G-CSF的乳腺癌細(xì)胞可造成小鼠紅細(xì)胞生成系統(tǒng)紊亂,骨髓紅細(xì)胞生成受到抑制,脾紅細(xì)胞生成功能增強(qiáng)。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)是紅細(xì)胞生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子,機(jī)體內(nèi)的EPO主要是由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。G-CSF是否可通過改變機(jī)體EPO水平影響造血系統(tǒng),目前尚缺乏有效的文獻(xiàn)支持。研究G-CSF誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成系統(tǒng)功能紊亂的機(jī)制,從不同角度評(píng)價(jià)G-CSF對(duì)機(jī)體的作用,可使我們更好的理解G-CS F的藥理活性和不良反應(yīng),并有助于進(jìn)一步闡明G-CSF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為G-CSF臨床合理用藥和腫瘤治療提供重要參考；同時(shí)可拓展我們對(duì)脾臟功能的認(rèn)識(shí),有利于深入理解機(jī)體紅細(xì)胞生成系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制。[研究目的]研究粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)誘導(dǎo)脾臟紅細(xì)胞生成的作用機(jī)制,分析EPO在脾紅細(xì)胞生成中的功能,評(píng)價(jià)腎臟功能對(duì)脾紅細(xì)胞生成能力的影響。[研究方法]1.給予C57BL/6J小鼠皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119 (或APC Rat Anti-Mouse Ter119)和PE Rat Anti-MouseCD71雙參數(shù)標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞中Ter119和CD71雙陽(yáng)性(CD71+Ter119+)細(xì)胞群體所占比例。2.給予小鼠皮下注射G-CSF,采用APC Rat Anti-Mouse Ter119 和 Thiazole orange雙參數(shù)標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞中網(wǎng)織紅細(xì)胞(Ter119+Thiazole orange+)和有核紅細(xì)胞(原紅細(xì)胞和幼紅細(xì)胞,Ter119+Thiazole orange++)占總細(xì)胞比例。3.給予小鼠皮下注射G-CSF,對(duì)小鼠骨髓與外周血進(jìn)行細(xì)胞涂片,采用Wright-Giemsa染色,顯微鏡下觀察。4.給予皮下注射G-CSF,取小鼠脾臟細(xì)胞原代培養(yǎng)CFU-E (Colony Forming Units-erythrocyte),顯微鏡下觀察CFU-E集落形成情況。5.為探究G-CSF誘導(dǎo)的脾臟紅細(xì)胞生成作用是否與EPO有關(guān),給予小鼠皮下注射G-CSF,心臟取血,離心取血清,采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中EPO的濃度。6.給予小鼠皮下注射G-CSF,取小鼠腎臟,提取組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄成DNA后通過RT-PCR檢測(cè)小鼠體內(nèi)腎臟組織中EPO的mRNA水平。7.給予小鼠皮下注射促紅細(xì)胞生成素EPO,取小鼠脾臟,制成單細(xì)胞懸液,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+各細(xì)胞群體所占比例。8.給予小鼠體內(nèi)注射EPO,取小鼠脾臟,制成單細(xì)胞懸液,Ter119/噻唑橙雙染流式檢測(cè)小鼠脾臟中Ter119+ Thiazole orange+(網(wǎng)織紅細(xì)胞),Ter119+ Thiazole orange++(原紅細(xì)胞和幼紅細(xì)胞)群體所占比例。9.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時(shí),給予小鼠尾靜脈輸紅細(xì)胞,采用FITC Rat Anti-Mouse Terl 19/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞,觀察網(wǎng)織紅細(xì)胞與原紅幼紅細(xì)胞所占比例。10.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時(shí),給予小鼠注射EPO抗體,封閉小鼠體內(nèi)EPO,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞群體所占比例。采用Ter119/ Thiazole orange雙染流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞,觀察網(wǎng)織紅細(xì)胞與原紅幼紅細(xì)胞所占比例。11.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF的同時(shí),給予小鼠喂服腺嘌呤,破壞小鼠雙腎,阻斷EPO分泌,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞群體所占比例。采用Ter119/Thiazole orange雙染流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞,觀察網(wǎng)織紅細(xì)胞與原紅幼紅細(xì)胞所占比例。12.給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF,后對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠實(shí)施雙側(cè)腎臟切除手術(shù),阻斷EPO來源。2天后,處死小鼠,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71雙染法流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞群體所占比例。采用Ter119/噻唑橙雙染流式檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞,觀察成熟紅細(xì)胞,網(wǎng)織紅細(xì)胞與原紅幼紅細(xì)胞所占比例。13.給予小鼠體內(nèi)注射G-CS F,分別給藥1天、2天,取小鼠腎臟,提蛋白,采用免疫印跡法檢測(cè)在受G-CSF刺激后小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、HIF-2a的表達(dá)情況。[研究結(jié)果]1.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后,小鼠股骨變白,骨髓細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞比例下降。相對(duì)應(yīng)小鼠脾臟變大,顏色加深,細(xì)胞數(shù)增多,細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞比例上升。2.在給予小鼠體內(nèi)注射G-CSF后,噻唑橙染色結(jié)果得出小鼠脾臟細(xì)胞Ter119+Thiazole orange+,Ter119+Thiazole orange++群體均有顯著上升,而小鼠骨髓細(xì)胞中Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++細(xì)胞均明顯減少。3.細(xì)胞涂片結(jié)果顯示：注射了G-CSF、鼠的骨髓細(xì)胞中紅細(xì)胞數(shù)減少,粒細(xì)胞數(shù)增多。注射了G-CSF小鼠的外周血細(xì)胞涂片結(jié)果顯示：外周血中粒細(xì)胞總數(shù)增多。4.原代培養(yǎng)CFU-E結(jié)果顯示,皮下注射G-CSF后小鼠脾臟細(xì)胞中CFU-E明顯增多。5. ELISA測(cè)定小鼠血清中EPO結(jié)果顯示,給予小鼠G-CSF刺激以后,小鼠血清中EPO水平明顯上升。6. RT-PCR結(jié)果顯示,在給與小鼠G-CSF刺激后,小鼠腎臟中EPO的mRNA水平顯著上升。7.檢測(cè)受G-CSF刺激的小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 與 HIF-2α表達(dá)水平。Western b lot結(jié)果顯示,給與小鼠G-CSF刺激后,小鼠腎臟中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α 與 HIF-2α表達(dá)水平上升。8.給予小鼠外源性EPO刺激后,小鼠脾臟細(xì)胞中Ter119+CD71+細(xì)胞比例上升。APC Rat Anti-Mouse Ter119和噻唑橙染色結(jié)果顯示脾臟細(xì)胞中Ter119+ Thiazole orange+(網(wǎng)織紅細(xì)胞),Ter119+ Thiazole orange++(原紅細(xì)胞和幼紅細(xì)胞)群體均有顯著上升。9.在使用G-CSF刺激小鼠后,給小鼠尾靜脈輸入紅細(xì)胞,流式檢測(cè)脾臟細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)相比G-CSF給藥組,G-CSF給藥同時(shí)輸紅細(xì)胞組Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+Thiazole orange+, Ter119+Thiazole orange++細(xì)胞比例降低至正常對(duì)照組小鼠水平。10.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下,給小鼠注射一定量的EPO抗體封閉小鼠體內(nèi)EPO的功能,流式檢測(cè)脾臟細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,ter119+Thiazole orange++細(xì)胞比例恢復(fù)至正常對(duì)照組小鼠水平。11.在小鼠受到G-CSF刺激的情況下,同時(shí)給予小鼠喂服腺嘌呤,小鼠脾臟細(xì)胞數(shù)恢復(fù)正常,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其脾臟細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++細(xì)胞比例恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。如果同時(shí)再給脾臟恢復(fù)正常的小鼠外源EPO刺激,脾臟再度增大,細(xì)胞數(shù)增多,Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++細(xì)胞比例再次上升。12.給小鼠G-CSF刺激一段時(shí)間后,切除小鼠雙側(cè)腎臟,兩天后取脾臟,發(fā)現(xiàn)鼠脾臟明顯縮小,流式檢測(cè)其脾臟細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++細(xì)胞比例相比G-CSF給藥組亦明顯降低。而后再給脾臟恢復(fù)正常的小鼠外源EPO刺激,脾臟再度增大,Ter119+CD71+細(xì)胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,Ter119+ Thiazole orange++細(xì)胞比例再次上升。[結(jié)論]粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)抑制小鼠骨髓紅細(xì)胞生成,造成機(jī)體缺氧,促進(jìn)腎臟缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腎臟間質(zhì)細(xì)胞分泌促紅細(xì)胞生成素(EPO),然后刺激小鼠脾臟紅細(xì)胞生成。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1213590