本文關(guān)鍵詞：Erbin反饋調(diào)控Akt-Skp2-p27通路影響腫瘤細胞增殖的研究

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【摘要】：背景Erbin(Erb B2 interacting protein),作為Erb B2一種新的結(jié)合蛋白,在2000年被發(fā)現(xiàn)并因此而命名。Erbin屬于LAP蛋白家族的新成員,其結(jié)構(gòu)主要包括:C端的一個PDZ結(jié)構(gòu)域以及N端的16個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域。Erbin通過PDZ結(jié)構(gòu)域和Erb B2的C端特異性結(jié)合,引導(dǎo)Erb B2定位在基底膜,維持細胞的極性;并且作為支架蛋白通過其自身的結(jié)構(gòu)域與其它相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域相互作用進而發(fā)揮其功能。Erbin與β-catenin等連環(huán)蛋白相互作用,而進入細胞骨架網(wǎng)絡(luò),參與上皮細胞的粘附以及橋粒的形成。近年來研究發(fā)現(xiàn),一些維持上皮細胞極性的分子同時參與細胞周期的調(diào)控。此外,Erbin作為接頭蛋白,在特定條件下負性調(diào)控TGF-β/Smads、Ras/Raf-1/ERK以及Nod2/NF-κB細胞信號通路。由此可見,Erbin是一個“多種角色”的極性分子。迄今為止,Erbin還沒有特異性的商品化抗體,我們實驗室早期制備純化了Erbin抗體,做Western blot實驗時發(fā)現(xiàn),敲低Erbin通過下調(diào)p21、p27具有促進腫瘤細胞增殖與遷移功能,并且在我們隨后的研究中發(fā)現(xiàn)Erbin具有調(diào)節(jié)Akt-Skp2通路的功能。這些線索強烈的提示,Erbin在相關(guān)的癌基因功能中可能作為重要調(diào)控因子。但是Erbin是怎樣調(diào)控Skp2介導(dǎo)的細胞增殖、遷移與相關(guān)癌基因功能的這些問題還沒有被解決。Skp2由蛋白-蛋白相互作用模塊、F-box序列、“Linker”序列依次連接而成(如亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域),是能與S期激酶Cyclin A-CDKI相互作用的蛋白。研究顯示Skp2在不同種類的細胞中起主導(dǎo)作用的調(diào)控機制不同,其表達受轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的雙重調(diào)控。為了抑制細胞增殖,可以通過調(diào)控Skp2的表達進而增加p27的穩(wěn)定性來實現(xiàn)。在前列腺癌中的研究顯示,抑癌基因蛋白PTEN的表達與Skp2的表達相關(guān),由此推斷抑癌基因PTEN參與Skp2表達的調(diào)控。PTEN基因在人類癌癥中通常是缺失的,其通過抑制Akt信令發(fā)揮著腫瘤抑制基因的作用。因此對于因PTEN基因的功能缺損或失活而導(dǎo)致Akt信令解除控制的腫瘤來說,Skp2蛋白或可成為一個有效的治療標靶。Skp2與細胞周期調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān),這些都是通過其對多種靶蛋白的泛素化降解來實現(xiàn)的。在最近對Erbin的實驗研究中,我們的實驗結(jié)果顯示Skp2作為Erbin的E3泛素連接酶存在。由此提示,Erbin和Skp2之間可能存在相互作用,并且Skp2介導(dǎo)的細胞增殖、遷移與相關(guān)癌基因功能可能依賴于Erbin。目的探討Erbin通過Akt-Skp2-p27信號通路調(diào)控腫瘤細胞增殖的分子機制。方法(1)利用Western Blot實驗,以不同的實驗條件在多種細胞中檢測Akt-Skp2-p27信號通路中多種內(nèi)源性或外源性蛋白的表達情況。(2)應(yīng)用免疫熒光(IF)實驗,以不同的實驗條件,在He La細胞中檢測Erbin、Skp2在細胞中的定位變化。(3)經(jīng)免疫共沉淀(Co-IP)實驗,檢測He La細胞中,敲低Erbin對Skp2磷酸化和乙酰化的影響;Erbin與Skp2是否存在相互作用。(4)經(jīng)免疫組化實驗,檢測腫瘤組織中Erbin與Skp2的表達。(5)經(jīng)ATP、EDU、集落形成、劃痕實驗,在He La細胞中檢測細胞增殖或遷移。(6)利用體內(nèi)實驗建立移植瘤模型,檢測Erbin丟失后癌細胞在體內(nèi)的增殖。結(jié)果(1)Western Blot實驗結(jié)果顯示,下調(diào)Erbin通過p27的降解促進了內(nèi)源性與外源性Skp2的穩(wěn)定性;Akt-Skp2反饋信號調(diào)控Erbin表達。(2)免疫熒光(IF)實驗檢測到,Erbin主要定位在細胞膜和相鄰細胞的連接處;敲低Erbin增強了Skp2蛋白的穩(wěn)定性,但并未影響Skp2的定位,未觀察到Akt激活引起Skp2胞質(zhì)定位增加。(3)經(jīng)免疫共沉淀(Co-IP)實驗檢測到,敲低Erbin促進Skp2的磷酸化和乙酰化;Erbin與Skp2存在相互作用。(4)經(jīng)免疫組化實驗觀察到,在乳腺癌組織中,Erbin與Skp2的表達呈負相關(guān)。(5)經(jīng)ATP、EDU、集落形成、劃痕實驗觀察到,在He La細胞中,Erbin丟失促進細胞增殖,Erbin對細胞遷移行為的調(diào)控依賴于Skp2。(6)經(jīng)體內(nèi)實驗,建立移植瘤模型后,發(fā)現(xiàn)Erbin丟失促進了癌細胞在體內(nèi)的增殖。結(jié)論通過研究,我們證實:Erbin在多種上皮性腫瘤中表達失調(diào),Erbin缺失導(dǎo)致細胞周期S期加快,增殖異常;揭示Erbin參與腫瘤細胞G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)控的分子機制。Erbin缺失促進Akt-Skp2-p27信號軸激活,而Akt-Skp2活化又促進Erbin降解;Erbin既是Skp2的降解底物又調(diào)控Akt依賴的Skp2蛋白穩(wěn)定性及活性。總之,本研究揭示了一個Akt-Skp2-p27的負調(diào)控分子,并提示Erbin在維持細胞極性之外的的新功能,即作為細胞周期的剎車分子,在維持細胞周期正常行進中具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

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