本文關(guān)鍵詞：曲妥珠單抗—納米金探針制備及對乳腺癌細胞體外生長抑制作用

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【摘要】：目的：構(gòu)建新型曲妥珠單抗-納米金生物探針,研究其對乳腺癌細胞的作用,探尋乳腺癌納米靶向治療新方法。方法：采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備不同尺寸(10nm、20 nm和40 nm)金納米粒子(GNPs),并行透射電鏡(TEM)表征,同時40 nm GNPs還進行紫外可見吸收光譜、水動力尺寸、zeta電位等檢測。通過靜電吸附原理將40 nm GNPs與曲妥珠單抗(Herceptin)偶聯(lián)合成曲妥珠單抗-納米金(Herceptin-GNPs)生物探針,表征方法同40 nmGNPs,并采用BCA蛋白定量法測Herceptin-GNPs中抗體偶聯(lián)量。人乳腺癌細胞株BT474和MCF-7細胞表皮生長因子受體-2(HER2)表達情況采用免疫細胞化學(xué)法檢測。采用掃面電子顯微鏡(SEM)觀察BT474細胞膜表面的Herceptin-GNPs吸附作用。分別設(shè)置10 nm、20 nm和40 nm GNPs濃度為12.5～100 μg/mL4個濃度,分別設(shè)置Herceptin-GNPs和Herceptin濃度為0.625～10 μg/mL 5個濃度,并設(shè)置對照組和空白組,作用于BT474和MCF-7細胞48 h,采用MTT法檢測各組細胞增殖抑制情況。分別設(shè)置Herceptin-GNPs和Herceptin濃度為1.25、2.5、5μg/mL3個濃度,并設(shè)置對照組,采用Annexin V-FITC/PI雙染、PI單染法行流式細胞術(shù)檢測BT474細胞凋亡率和周期變化情況,以及采用Western Blot技術(shù)分別檢測p-AKT、p-MAPK、Bcl-2、HER2蛋白表達情況。結(jié)果：(1)檸檬酸還原法制備的不同尺寸GNPs (10 nm、20 nm和40 nm)水溶液呈酒紅色,澄清透亮,TEM結(jié)果顯示GNPs近似圓形,平均粒徑大小分別為10.2±1.2 nm、20.9±2.0 nm和40.7±2.2 nm。通過紫外可見吸收光譜、水動力尺寸、zeta電位、TEM檢測,證實成功合成Herceptin-GNPs探針,BCA法測得每毫升Herceptin-GNPs探針抗體偶聯(lián)量為11.3嵋,抗體偶聯(lián)率約為37.67%,經(jīng)計算得每個40 nm GNP表面可以連接約633個Herceptin分子。(2)免疫細胞化學(xué)方法證明人乳腺癌MCF-7細胞HER2低表達,BT474細胞HER2高表達。在不同尺寸GNPs毒性研究方面,可見10 nm GNPs在50 ng/mL可抑制BT474細胞增殖,而在100ng/mL時可抑制MCF-7細胞增殖,而20nm和40 nm在100 μg/mL及以下濃度時均未對兩株細胞顯示出明顯增殖抑制作用,提示GNPs細胞毒性低。(3)不同濃度Herceptin和Herceptin-GNPs對BT474細胞生長具有劑量依賴的抑制作用,Herceptin-GNPs較單獨應(yīng)用Herceptin抑制作用更強。流式細胞術(shù)檢測顯示Herceptin-GNPs和Herceptin均誘導(dǎo)BT474細胞凋亡,阻滯細胞子G0/G1期,且Herceptin-GNPs作用強于Herceptin。Western Blot結(jié)果顯示, Herceptin-GNPs和Herceptin均可降低AKT、MAPK蛋白磷酸化水平,下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達,誘導(dǎo)細胞凋亡,降低HER2蛋白表達,且Herceptin-GNPs作用強于Herceptin。結(jié)論：檸檬酸還原法制備的GNPs細胞毒性低,生物相容性好；Herceptin-GNPs較單獨應(yīng)用Herceptin能顯著抑制HER2陽性乳腺癌BT474細胞增殖,抑制下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)細胞凋亡,增加HER2內(nèi)吞,在減少Herceptin用藥劑量同時療效增加,為HER2過表達乳腺癌的靶向治療提供了新的方法。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：1208718