本文關(guān)鍵詞：抑癌基因PRSS8在結(jié)直腸癌中的機制研究

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【摘要】：背景在美國,結(jié)直腸癌(CRC)是排名第三的常見惡性腫瘤疾病,在與癌癥相關(guān)的死亡原因中結(jié)直腸癌排名第二,轉(zhuǎn)移是發(fā)生死亡的主要原因。數(shù)十年的研究顯示,腫瘤抑制基因的失活或表達降低,和癌基因的激活或表達增高導(dǎo)致的致癌信號通路的激活比如Wnt/β-catenin,炎癥信號等都與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展有關(guān)。人絲氨酸蛋白酶8,又被稱為prostasin(PRSS8),最初被發(fā)現(xiàn)在前列腺和精液中表達非常高。目前的研究已經(jīng)證實,PRSS8作為抑癌基因,對于前列腺癌,乳腺癌,膀胱癌,胃癌等的發(fā)生發(fā)展有著非常重要的影響。本研究通過基因表達譜分析,發(fā)現(xiàn)PRSS8在結(jié)直腸癌組織中表達明顯降低,但是它在結(jié)直腸癌中的作用機制尚不清楚。目的以人結(jié)直腸癌組織標本,結(jié)腸癌細胞系和裸鼠以及基因敲除小鼠為研究對象,探討PRSS8在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。方法1.免疫組化,染色強度評估和生存期分析:使用免疫組織化學(xué)染色對含有282例有隨訪資料的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的組織芯片(TMA)進行檢測,分析PRSS8蛋白在結(jié)腸癌和正常組織中的表達差異。另外,還使用免疫組化染色對包括72對食管癌組織和其相匹配的正常組織,117對肝癌組織和其相匹配的正常組織,46對前列腺組織和其相匹配的正常組織或腺瘤,75對乳腺癌組織和其相匹配的正常組織或腺瘤的組織芯片進行檢測。染色強度根據(jù)0(沒有染色),1(微弱染色),2(中度染色),3(重度染色)來計分,病人生存期通過Kaplan-Meier法和GraphPad Prism 5.0軟件分析。2.實時熒光定量PCR(qRT-PCR):從38例冰凍的結(jié)直腸癌組織和其配對的正常組織手術(shù)標本中提取總RNA,然后使用qRT-PCR方法檢測PRSS8的mRNA表達水平。3.培養(yǎng)細胞,構(gòu)建質(zhì)粒,合成siRNA和轉(zhuǎn)染:構(gòu)建過PRSS8的表達質(zhì)粒,以及sirna,培養(yǎng)hek29和結(jié)腸癌細胞系hct116,sw480,caco2,hct8細胞,轉(zhuǎn)染細胞系。通過westernblot檢測prss8的表達與wnt/β-catenin信號通路,sphk1/s1p/stat3/akt信號通路,emt信號通路的關(guān)系。通過mtt法檢測結(jié)腸癌細胞系的增殖能力,通過流式細胞儀檢測細胞周期的改變,通過劃痕實驗和transwell法檢測結(jié)腸癌細胞的遷移和運動能力,使用red-phalloidin染色方法檢測細胞骨架和形態(tài)學(xué)的改變,通過top/fop報告基因系統(tǒng)檢測prss8對β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響,通過免疫共沉淀和共定位分析來探討prss8與sphk1之間的相互作用。4.裸鼠成瘤實驗:將pflag-prss8穩(wěn)定過表達的hct116細胞系和陰性對照組(1.5x106/只)分別皮下注射到8周左右的正常裸鼠背部兩側(cè),每組十只裸鼠,接種30天后,殺死小鼠,取出背部腫瘤,統(tǒng)計腫瘤的大小(g)和體積(cm3),通過免疫組化和westernblot進行檢測分析。5.sphk1+/+和-/-小鼠:將8周齡的sphk1+/+和-/-小鼠處死后,收集結(jié)腸組織,在福爾馬林溶液中固定后,用prss8抗體進行免疫組化染色。通過aperioimagescope軟件對免疫組化染色強度進行分析。結(jié)果1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中prss8蛋白的表達水平降低,而且與結(jié)直腸癌的病理分化程度和生存期成正相關(guān)。同結(jié)直腸癌相似,prss8的表達水平在食管癌和肝癌中較正常組織低。與以前的研究相一致,同乳腺和前列腺腺瘤相比,prss8在乳腺癌和前列腺癌中表達降低。另外,prss8的表達水平與食管癌,肝癌,乳腺癌和前列腺癌的分化呈正相關(guān)。2.qrt-pcr結(jié)果顯示在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中prss8mrna表達水平降低。3.westernblot結(jié)果顯示:prss8過表達能夠抑制emt信號通路,wnt/β-catenin信號通路,sphk1/s1p/stat3/akt信號通路;干擾prss8的表達能夠激活emt信號通路,wnt/β-catenin信號通路,sphk1/s1p/stat3/akt信號通路。4.(1)通過mtt法繪制細胞生長曲線的結(jié)果顯示:與對照組相比,prss8轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力被顯著抑制,而prss8干擾組細胞的增殖能力顯著增強。(2)劃痕實驗和transwell法結(jié)果顯示:與對照組相比,prss8轉(zhuǎn)染組細胞的遷移和運動能力被顯著抑制,而PRSS8干擾組細胞的遷移和運動能力顯著增強。PRSS8過表達能夠?qū)е耂W480和HCT116細胞周期阻滯于G1/G2期,能夠?qū)е翲CT116細胞發(fā)生細胞骨架和形態(tài)的改變。在HEK293細胞系中,過表達PRSS8能夠抑制β-catenin/TCF4熒光素酶活性。免疫共沉淀和共定位分析結(jié)果顯示,PRSS8與sphk1在細胞內(nèi)能夠形成復(fù)合物發(fā)揮作用。5.過表達PRSS8后能夠明顯抑制裸鼠腫瘤的生長,從腫瘤大小和體積上減緩腫瘤的生長。6.利用免疫組化染色,相對于sphk1+/+小鼠,sphk1-/-小鼠結(jié)腸組織中PRSS8表達水平升高。結(jié)論1.PRSS8在結(jié)直腸癌中是一個抑癌基因,可以抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力,以及EMT信號通路,Wnt/β-catenin信號通路,Sphk1/S1P/Stat3/Akt信號通路,與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.PRSS8與結(jié)直腸癌的病理分化程度和生存期呈正相關(guān),可作為檢測結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展以及預(yù)測結(jié)直腸癌病人預(yù)后的生物標志物。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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1 王漢濤 ,Kraemer M.;隨訪危險因素分析:復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌的比較[J];中國實用外科雜志;2001年12期

2 蘇森;患結(jié)直腸癌婦女后代癌癥的危險性增加[J];中國腫瘤;2001年06期

3 汪一虹;在確定的法國人群中年齡<45歲結(jié)直腸癌病人與≥45歲結(jié)直腸癌病人的比較[J];國外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊);2002年01期

4 李會晨;結(jié)直腸癌解剖位置的連續(xù)性右向遷移[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊;2003年03期

5 李志霞;結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的綜合治療[J];中華胃腸外科雜志;2003年06期

6 何建苗,蒲永東,曹志宇,劉衛(wèi)平;老年人結(jié)直腸癌186例的外科治療[J];中華胃腸外科雜志;2003年05期

7 保紅平,方登華,高瑞崗,李奎,張雪松,劉天錫;青年人結(jié)直腸癌臨床病理分析[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2004年01期

8 章江;;監(jiān)測結(jié)直腸癌非常必要[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2004年04期

9 郜文秀,楊艷芳,梁小波,李耀平,李佩珍;細胞粘附分子變異體在結(jié)直腸癌中的表達及預(yù)后[J];中國公共衛(wèi)生;2005年07期

10 Nozawa T. ,Enomoto T. ,Koshida Y. ,M. Kuranami,王志宇;人結(jié)直腸癌黏膜下血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子特異性增強表達[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(胃腸病學(xué)分冊);2005年06期

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1 鄭樹;;結(jié)直腸癌預(yù)后與轉(zhuǎn)移相關(guān)因素分析[A];2005年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)會議全國大腸癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的診治研討會學(xué)術(shù)論文集[C];2005年

2 鄒一峰;吳小劍;蘭平;;結(jié)直腸癌免疫治療新進展[A];第十一次全國中西醫(yī)結(jié)合大腸肛門病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

3 郁寶銘;;結(jié)直腸癌治療的進展及其新理念[A];2006年浙江省肛腸外科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

4 王錫山;;結(jié)直腸癌治療的困惑之我見[A];第九屆全國腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)術(shù)大會暨2011年黑龍江省醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)年會報告集[C];2011年

5 秦建平;;未病思想中的結(jié)直腸癌預(yù)防[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會肛腸學(xué)會第五屆學(xué)術(shù)交流會暨新技術(shù)新進展學(xué)習班論文匯編[C];2012年

6 高文慶;陳會林;童蕾;陸松春;;老年梗阻性結(jié)直腸癌診療體會(附42例報告)[A];首屆“之江中醫(yī)藥論壇”暨浙江省中醫(yī)藥學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2011年

7 王啟遠;周長江;高云飛;徐巖;李坤;;血管內(nèi)皮生長因子與結(jié)直腸癌[A];《中華急診醫(yī)學(xué)雜志》第八屆組稿會暨急診醫(yī)學(xué)首屆青年論壇論文匯編[C];2009年

8 巴一;;結(jié)直腸癌靶向治療進展[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

9 何超;朱洪波;;結(jié)直腸癌的生物治療[A];2009年浙江省腫瘤外科學(xué)術(shù)年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學(xué)習班論文匯編[C];2009年

10 萬德森;;進一步提高結(jié)直腸癌療效的思考[A];2009年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)年會暨腫瘤診治新進展學(xué)習班論文匯編[C];2009年

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1 中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會主任委員 顧晉;分期不精確 致結(jié)直腸癌過度治療[N];健康報;2012年

2 本報記者 賈巖;跨線治療成結(jié)直腸癌最后防線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

3 本報記者 賈巖;跨線治療構(gòu)筑結(jié)直腸癌最后防線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

4 本報記者 林琳;結(jié)直腸癌：可以治愈的癌癥[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2013年

5 記者 張妍　通訊員 熊靜帆 朱品磊;深圳結(jié)直腸癌發(fā)病高于全國[N];深圳商報;2013年

6 本報記者 孫剛;預(yù)防結(jié)直腸癌：請管住嘴[N];解放日報;2013年

7 上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科 侯鳳剛 副主任醫(yī)師;中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌治療中的作用和特色[N];上海中醫(yī)藥報;2014年

8 李華虹 孫瑜淼 記者 李麗云 實習生 陰浩;專家呼吁：結(jié)直腸癌應(yīng)多學(xué)科規(guī)范化診療[N];科技日報;2014年

9 ;降低結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)有新療法[N];人民日報;2003年

10 韓自力;新化療方案可高效治療結(jié)直腸癌[N];健康報;2007年

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1 陳濤;MicroRNA-31/FIH-1調(diào)控關(guān)系在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 任翡;MYBL2基因在結(jié)直腸癌的表達及機制的初步探討[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 吳朋;結(jié)直腸癌中microRNA-615基因甲基化及其生物學(xué)特性探究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 李澤武;MicroRNA-203靶向ZNF217基因調(diào)控結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的研究[D];山東大學(xué);2015年

5 徐興遠;低分子肝素對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響及相關(guān)機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

6 梁洪亮;miR-454在結(jié)直腸癌中的功能及其作用機制[D];山東大學(xué);2015年

7 金鵬;MMR蛋白在雌激素致結(jié)腸癌細胞凋亡中的作用及SEPT9檢測結(jié)直腸癌的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

8 珠珠;云南省Lynch綜合征候選基因標志物研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2014年

9 周智航;SEMA3F通過下調(diào)ASCL2-CXCR4軸而抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 王林;MiRNA-300對結(jié)直腸癌腫瘤侵襲和增殖的影響及其調(diào)控機制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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1 顏斐斐;術(shù)后結(jié)直腸癌患者癌因性疲乏與影響因素的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

2 李斌;結(jié)直腸癌患者就診延遲分析[D];中南大學(xué);2009年

3 葉建杰;慈溪市結(jié)直腸癌危險因素病例對照研究[D];浙江大學(xué);2008年

4 趙波;結(jié)直腸癌危險因素及臨床流行病學(xué)特征的調(diào)查與分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

5 崔娟娟;p53和nm23在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

6 宋青芳;正常腸道、癌前病變、結(jié)直腸癌相關(guān)微生物組學(xué)比較分析[D];昆明理工大學(xué);2015年

7 郭秀燕;結(jié)直腸癌術(shù)后生存分析[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

8 王靜;TL1A在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌動物模型中作用的初步探討[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

9 吳哲;Th17細胞在TL1A調(diào)控結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中作用的初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 肖華旭;通過microRNA-155下調(diào)SOCS-1在結(jié)直腸癌的表達促進其轉(zhuǎn)移和侵襲[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

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