本文關(guān)鍵詞：三氧化二砷、紫杉醇及聯(lián)合對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的作用

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【摘要】：目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma MM)以骨痛、溶骨性病變、病理性骨折和貧血為臨床特征,是一種漿細(xì)胞惡性克隆性增生性疾病,盡管目前多發(fā)性骨髓瘤治療方法多種多樣,包括化療、免疫治療及自體造血干細(xì)胞移植(autologousstem cell transpantation ASCT)等,但是至今仍不能徹底治愈,絕大多數(shù)患者都會(huì)因?yàn)閺?fù)發(fā)、耐藥等導(dǎo)致死亡,患者的中位生存期一般為3-5年。目前,通過(guò)臨床治療控制疾病進(jìn)展、改善患者生活質(zhì)量,延長(zhǎng)無(wú)病生存期是多發(fā)性骨髓瘤患者最理想狀態(tài),臨床上對(duì)初診的多發(fā)性骨髓瘤患者的治療普遍采用如M2、MP(美法侖+潑尼松)、VAD(長(zhǎng)春新堿+阿霉素+地塞米松)等方案,但這幾種方案都沒(méi)有徹底治愈患者。近年來(lái),隨著各種改良方案的不斷出現(xiàn),MM的聯(lián)合化療有了新的進(jìn)展,通過(guò)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制及耐藥機(jī)制等多方面的深入研究,新型藥物免疫抑制劑、蛋白酶體抑制劑等及單克隆抗體治療MM已經(jīng)在臨床上取得了較大成效,使治療的有效率、臨床緩解率、無(wú)病生存率均有明顯提高。但是所有患者會(huì)復(fù)發(fā)、耐藥仍是一大難題,需支付巨額醫(yī)療費(fèi)用也是很多患者及家庭放棄最好治療的一方面原因,因此新型藥物的不斷開(kāi)發(fā)固然勢(shì)在必行,而聯(lián)合化療方案的探求也值得關(guān)注。三氧化二砷(ATO)不僅在體外對(duì)多種實(shí)體瘤和血液腫瘤細(xì)胞有明顯抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用,在臨床上亦是得到廣泛應(yīng)用,其抗腫瘤作用得以充分發(fā)揮,尤其對(duì)惡性血液系統(tǒng)疾病的治療貢獻(xiàn)極大,有學(xué)者對(duì)ATO作用于人骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了研究,其結(jié)果表明:ATO對(duì)RPMI8226細(xì)胞的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用顯著;ATO將RPMI8226細(xì)胞阻滯在G1期;ATO作用后,對(duì)ERK1/2及其磷酸化蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,使細(xì)胞的VEGF表達(dá)及分泌量減少,Bcl-2蛋白表達(dá)下降。三氧化二砷能通過(guò)多重作用機(jī)制達(dá)到抗腫瘤的目的,如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制端粒酶活性等,因此也成為聯(lián)合化療用藥的選擇之一。紫杉醇也是臨床常用化療藥物,其主要抗腫瘤作用機(jī)制為抑制有絲分裂過(guò)程,使細(xì)胞周期停滯在G2/M期,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。該藥在肺癌、食管癌、卵巢癌等實(shí)體瘤中得到廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)主要包括過(guò)敏反應(yīng)、骨髓抑制、心臟毒性、神經(jīng)毒性反應(yīng)、癲癇發(fā)作等,嚴(yán)重者臨床表現(xiàn)可危及生命,已引起了臨床工作者重視,因此安全而有效的利用紫杉醇抗腫瘤也是學(xué)者們不斷追求的目標(biāo)。應(yīng)用紫杉醇對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞和臨床試驗(yàn)的研究均有明確的結(jié)論,證實(shí)其在惡性血液系統(tǒng)疾病中也具有明顯的誘導(dǎo)凋亡的作用。方法:不同濃度的三氧化二砷、紫杉醇及二者聯(lián)合處理人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的單藥紫杉醇(藥物濃度為0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5μmol/L)作用于RPMI8226細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(A組),實(shí)驗(yàn)組分為三氧化二砷單藥組(藥物濃度為1、2、4μmol/L)為B、C、D組,紫杉醇單藥組(藥物濃度為0.01μmol/L)為E組,二者聯(lián)合用藥組(藥物濃度為ATO 1μmol/L+PTX0.01μmol/L、2μmol/L+PTX0.01μmol/L、4mol/L+PTX0.01μmol/L)為F、G、H組,運(yùn)用倒置相差顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞凋亡及形態(tài)學(xué)變化;在不同的時(shí)間(24h、48h、72h)通過(guò)MTT比色法檢測(cè)RPMI8226細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞生長(zhǎng)率;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞周期的影響;采用Western blot檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cdc2、Cyclin D1的影響。結(jié)果:1 RPMI8226細(xì)胞形態(tài)的觀察倒置相差顯微鏡:實(shí)驗(yàn)中隨著紫杉醇作用時(shí)間的延長(zhǎng),多數(shù)RPMI8226細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形,成桿狀或梭形,細(xì)胞折光性逐漸變差,最后細(xì)胞膜變的不完整,形成較多細(xì)胞碎片。實(shí)驗(yàn)中三氧化二砷單藥組作用過(guò)的RPMI8226細(xì)胞隨濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng),出現(xiàn)細(xì)胞皺縮變小,核固縮,呈均勻的致密物,細(xì)胞膜不規(guī)則突起,細(xì)胞折光性差,直至細(xì)胞膜不完整,形成細(xì)胞碎片。聯(lián)合用藥組比相同濃度的單藥組凋亡及壞死細(xì)胞增多,細(xì)胞形態(tài)的改變與紫杉醇單藥組相似。2 MTT比色法測(cè)定RPMI8226細(xì)胞增殖抑制率2.1三氧化二砷組:相同作用時(shí)間下,隨著ATO藥物濃度的增加,對(duì)細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增加;相同濃度的ATO隨作用時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖抑制率增加,呈時(shí)間依賴性。其中,相同作用時(shí)間組中,各濃度之間均存在差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),相同。2.2紫杉醇組:實(shí)驗(yàn)中,相同作用時(shí)間,PTX濃度在0.01μmol/L-1μmol/L之間,細(xì)胞增殖抑制率恒定,無(wú)明顯劑量依賴,濃度在1μmol/L-3.5μmol/L之間,細(xì)胞增殖抑制率隨濃度的增加而升高;同一濃度的PTX,隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖抑制率升高。濃度為0.01μmol/L的紫杉醇24h、48h、72h的抑制率分別為20.09±9.11%、39.77±1.85%、54.39±3.75%。2.3聯(lián)合用藥組:不同濃度的ATO與同一濃度的PTX肽聯(lián)合,隨ATO濃度增加,細(xì)胞生長(zhǎng)率下降;以4μmol/L的ATO聯(lián)合0.01μmol/L的PTX作用于RPMI8226細(xì)胞48小時(shí)為例,其增殖抑制率為47.95±7.32%,而4μmol/L的ATO單獨(dú)作用于RPMI8226細(xì)胞48小時(shí)的增殖抑制率為32.98±6.07%,PTX0.01μmol/L單獨(dú)作用于RPMI8226細(xì)胞48小時(shí)的增殖抑制率為39.77±1.85%(P0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二者聯(lián)合對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用明顯,具有濃度、時(shí)間依賴性。3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期(PI染色):單藥及聯(lián)合用藥處理RPMI8226細(xì)胞,隨著藥物濃度的增加,存活細(xì)胞量明顯減少,凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組處于G0/G1期、S期細(xì)胞分別是27.45%、68.50%,而H組處于G2期、S期細(xì)胞分別是89.37%、8.48%,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間cdc2蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1蛋白表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1三氧化二砷與紫杉醇均可誘導(dǎo)人骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞凋亡,抑制該細(xì)胞的增殖。2兩者聯(lián)合作用能顯著提高RPMI8226細(xì)胞的凋亡率,增強(qiáng)抑制其生長(zhǎng)的作用。3三氧化二砷、紫杉醇及二者聯(lián)合使人骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,其可能是抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的有效途徑之一。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉道華;賴t熝，

本文編號(hào)：1197395