本文關(guān)鍵詞：PPFIA1在慢性粒細(xì)胞白血�。–ML）的功能及其相關(guān)磷酸化信號(hào)分子和相互作用蛋白的鑒定研究

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【摘要】：研究背景:前期通過(guò)基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中有多個(gè)靶基因,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PPFIA1受miR-181a的直接調(diào)控,初步鑒定PPFIA1具有癌基因功能,但PPFIA1在CML中確切的分子作用機(jī)制尚不清楚。研究目的:本課題致力于探索PPFIA1對(duì)CML惡性進(jìn)展的影響及其下游磷酸化信號(hào)分子和相互作用的蛋白鑒定,為白血病分子靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.利用PPFIA1慢病毒顆粒構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PPFIA1蛋白的K562細(xì)胞;Western Blot驗(yàn)證K562細(xì)胞內(nèi)PPFIA1表達(dá)水平;2.脂質(zhì)體Lipofectamine TM 3000轉(zhuǎn)染PPFIA-siRNA到K562細(xì)胞;3.Biotool Vita-Blue試劑檢測(cè)PPFIA1對(duì)K562細(xì)胞藥物敏感性的影響;4.甲基纖維素集落形成法檢測(cè)PPFIA1對(duì)K562細(xì)胞增殖能力的影響;5.Transwell小室法檢測(cè)PPFIA1對(duì)K562細(xì)胞侵襲能力的影響;6.磷酸化抗體芯片檢測(cè)靶向抑制PPFIA1后K562細(xì)胞相應(yīng)磷酸化蛋白表達(dá)水平的改變,并在K562和KCL-22細(xì)胞中使用Western Blot驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)分子的改變;7.利用flag-PPFIA1慢病毒顆粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)flag-PPFIA1融合蛋白的K562細(xì)胞株,flag-BCR/ABL和myc-PARP1質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)flag-BCR/ABL的293T細(xì)胞株;8.免疫沉淀(IP)flag-PPFIA1和flag-BCR/ABL融合蛋白,利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)鑒定兩組ip產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)組成。9.discoverystudio4.5client軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間模擬對(duì)接,分別預(yù)測(cè)與ppfia1及bcr/abl蛋白直接作用的特異性蛋白,對(duì)免疫沉淀產(chǎn)物中的特異性蛋白質(zhì)分子進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。10.parp1抑制劑olaparib處理k562-lentivppfia1后cck8檢測(cè)藥物敏感性及細(xì)胞克隆形成能力的變化。研究結(jié)果:1.westernblot檢測(cè)病毒感染后k562-ppfia1lentiv比k562-emptylentiv細(xì)胞內(nèi)的ppfia1蛋白表達(dá)水平明顯升高;2.過(guò)表達(dá)ppfia1基因后降低了k562細(xì)胞對(duì)imatinib和dasatinib的藥物敏感性,增強(qiáng)了k562細(xì)胞的colony形成和侵襲能力;3.靶向抑制ppfia1增強(qiáng)了k562細(xì)胞對(duì)imatinib的藥物敏感性,減弱了k562細(xì)胞的colony形成和侵襲能力;4.磷酸化芯片顯示,靶向抑制ppfia1蛋白磷酸化水平下降率高于20%的蛋白有28種。其中c-kit(tyr721)磷酸化水平下降最明顯,達(dá)76%,westernblot結(jié)果顯示ppfia1能激活c-kit、akt、erk1/2磷酸化信號(hào)通路,靶向抑制ppfia1可以降低其磷酸化信號(hào)水平。5.質(zhì)譜鑒定flag-bcr/abl免疫沉淀產(chǎn)物有132種特異性蛋白,而flag-ppfia1免疫沉淀產(chǎn)物有42種,其中parp1和ncoa5是flag-ppfia1和flag-bcr/abl兩個(gè)免疫沉淀產(chǎn)物中共同存在的蛋白質(zhì)分子。6.空間模擬對(duì)接和免疫共沉淀(co-ip)結(jié)果顯示ppfia1能和parp1相互直接結(jié)合。7.parp1抑制劑olaparib能顯著減弱k562-lentivppfia1細(xì)胞的活力和colony形成能力。8.過(guò)表達(dá)ppfia1可以激活parp1/p65/c-kit的磷酸化表達(dá)水平,靶向抑制ppfia1和parp1均可抑制p65和c-kit的磷酸化表達(dá)水平。研究結(jié)論:1.PPFIA1在CML中具有癌基因功能,靶向抑制PPFIA1基因的表達(dá)可以抑制CML惡性進(jìn)展。2.PPFIA1下游涉及C-KIT等28個(gè)磷酸化信號(hào)分子。3.PPFIA1能與PARP1蛋白結(jié)合,促進(jìn)P65轉(zhuǎn)錄進(jìn)而激活C-KIT磷酸化信號(hào)通路,增強(qiáng)CML惡性進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.72

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