本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-491靶向作用EGFR通過STAT3信號通路在肝細(xì)胞癌腫瘤干細(xì)胞特性中作用的機(jī)制研究

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【摘要】：目的闡述mi R-491對肝癌腫瘤干細(xì)胞特性獲得的分子調(diào)控機(jī)制及其對肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的影響,為今后肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后復(fù)發(fā)的診斷、靶向治療以及患者預(yù)后預(yù)測提供新的途徑和研究思路。方法一、mi R-491在腫瘤組織、正常組織的表達(dá)與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)關(guān)系1.肝癌組織與正常組織mi RNA-491表達(dá)差異檢測:實時定量轉(zhuǎn)錄PCR(q RT-PCR)方法檢測mi RNA-491在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá);2.肝癌細(xì)胞mi R-491和檢測:實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(q RT-PCR)方法檢測mi R-491在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平;二、mi R-491影響肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得mi R-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞集落形成能力及腫瘤干細(xì)胞成球能力影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H和Hep G2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic/inhibitor,腫瘤細(xì)胞集落形成實驗及懸浮克隆細(xì)胞球形成實驗檢測腫瘤干細(xì)胞性的變化。三、mi R-491在肝癌細(xì)胞系中通過EGFR調(diào)控STAT31.mi R-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞EGFR和STAT3表達(dá)影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H和Hep G2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic/inhibitor,Western blot檢測EGFR和STAT3蛋白及磷酸化水平變化;2.mi R-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞EGFR的影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染p EGFP-EGFR 3'UTR-Luc和mi R-491-mimic,肝癌細(xì)胞Hep G2內(nèi)共轉(zhuǎn)染p EGFP-EGFR 3'UTR-Luc和mi R-491-inhibitor,熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測EGFR熒光素酶活性變化;3.EGFR表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞STAT3的影響檢測:肝癌細(xì)胞Hep G2內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor 24 h后,繼續(xù)用EGFR si RNA處理細(xì)胞12h,Western blot檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化,肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic24 h后,繼續(xù)用EGFR高表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞12h,Westem blot檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化。四、EGFR/STAT3對肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得及侵襲轉(zhuǎn)移的影響1.EGFR/STAT3表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力影響及腫瘤細(xì)胞集落形成能力檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒和肝癌細(xì)胞Hep G2細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor及STAT3 si RNA,懸浮克隆細(xì)胞球形成實驗及集落形成實驗檢測腫瘤干細(xì)胞成球能力變化。2.EGFR/STAT3表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒和肝癌細(xì)胞Hep G2細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor及STAT3 si RNA,transwell實驗檢測腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。結(jié)果一、mi R-491和肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤組織相關(guān)qRT-PCR方法分別檢測肝癌細(xì)胞系和肝癌組織、正常組織mi R-491表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn):mi R-491表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān),在肝癌組織中表達(dá)遠(yuǎn)低于正常組織。二、mi R-491影響肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic的MHCC97H細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力較對照組顯著降低;而轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor的Hep G2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力較對照組明顯升高。三、mi R-491在肝癌細(xì)胞系中通過EGFR調(diào)控STAT31.在肝癌細(xì)胞MHCC97H中上調(diào)mi R-491后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白水平明顯降低,STAT3蛋白磷酸化水平均明顯降低;而肝癌細(xì)胞Hep G2下調(diào)mi R-491后,EGFR蛋白水平明顯升高,STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高;2.肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染p EGFP-EGFR 3'UTR-Luc和mi R-491-mimic,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與mi R-491啟動子區(qū)能夠結(jié)合,上調(diào)mi R-491水平,EGFR熒光素酶活性下降,肝癌細(xì)胞Hep G2內(nèi)共轉(zhuǎn)染p EGFP-EGFR-3'UTR-Luc和mi R-491-inhibitor,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與mi R-491啟動子區(qū)能夠結(jié)合,下調(diào)mi R-491水平,EGFR熒光素酶活性上升。說明在肝癌細(xì)胞中,mi R-491可以直接靶向調(diào)控EGFR;3.使用mi R-491-inhibitor處理Hep G2細(xì)胞后,再用EGFR si RNA處理Hep G2細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制EGFR可使mi R-491所致Hep G2細(xì)胞STAT3的蛋白磷酸化水平升高回降;使用mi R-491-mimic處理MHCC97H細(xì)胞后,再用EGFR高表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)EGFR可使mi R-491所致MHCC97H細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化水平降低回升。說明mi R-491所致肝癌細(xì)胞STAT3表達(dá)水平變化是通過EGFR來完成的。四、mi R-491/STAT3對肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響1.肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力亦明顯減弱,共轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)STAT3可使mi R-491-mimic所致腫瘤干細(xì)胞成球能力及集落形成減弱回高;肝癌細(xì)胞Hep G2內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力明顯升高,共轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor及STAT3 si RNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)STAT3可使mi R-491-inhibitor所致腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力能力升高回降。2.肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱,共轉(zhuǎn)染mi R-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)STAT3可使mi R-491-mimic所致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱回高;肝癌細(xì)胞Hep G2內(nèi)轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯升高,共轉(zhuǎn)染mi R-491-inhibitor及STAT3 si RNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)STAT3可使mi R-491-inhibitor所致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力升高回低。結(jié)論1.mi R-491和腫瘤細(xì)胞惡性程度及肝癌分期相關(guān);2.mi R-491在肝癌細(xì)胞中抑制腫瘤干細(xì)胞特性獲得;3.mi R-491通過靶蛋白EGFR調(diào)控STAT3;4.EGFR/STAT3參與了HCC的腫瘤干細(xì)胞特性獲得過程及侵襲轉(zhuǎn)移能力過程�？傊�,本研究結(jié)果提示mi R-491可以通過調(diào)控靶蛋白EGFR降低STAT3的磷酸化水平,抑制肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性獲得,從而影響腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果說明mi R-491與肝癌干細(xì)胞特性獲得的通路調(diào)控在肝癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1187677