本文關鍵詞：EZH2調(diào)控急性髓系白血病細胞髓外浸潤及其分子機制研究

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【摘要】：背景與目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤之一,白血病細胞在骨髓中無限增殖和向髓外組織浸潤,死亡率非常高,盡管近年來化療方案的不斷改進提高了白血病的誘導緩解率,但其復發(fā)率仍較高。其中的原因之一是白血病髓外浸潤。初診AML患者有30～40%可伴有髓外浸潤(extramedullary infiltration, EMI),主要臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、齒齦增生、皮膚浸潤、肝脾腫大及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯等。有文獻顯示EMI在M4和M5類型(FAB) AML中的發(fā)生率較其他類型高,且伴有EMI的AML患者往往預后較差,特別是在伴有t(8；21)異常核型的AML患者。作為PRC2催化活性亞基,果蠅zeste基因增強子的人類同源基因2 (enhancer of zeste homolog 2, EZH2),起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。它主要通過對核小體組蛋白H3K27位點賴氰酸進行甲基化修飾,從而沉默抑癌基因、周期蛋白等基因的表達來參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及腫瘤的形成。大量的研究顯示EZH2在多種惡性實體腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、腎癌、大腸癌過表達,而且與腫瘤的侵襲性及較差預后相關。目前的研究顯示EZH2在高危的MDS及由其轉(zhuǎn)化而來的AML中過表達與較差預后相關,還有研究報道EZH2蛋白在AML患者中的高表達與LDH異常升高WBC≥50x109及較差預后顯著相關。本課題組研究發(fā)現(xiàn)AML患者EZH2的表達水平明顯高于正常對照組,且EZH2 mRNA的表達與外周白血病細胞比例顯著正相關。在不同細胞株中,U937和KG-1 α細胞的EZH2基因和蛋白表達水平均顯著低于Kasumi-1和HL60細胞(P0.05),同時前兩種細胞的遷移能力也明顯弱于后兩種細胞。我們推測EZH2在AML中可能與白血病細胞EMI有關。然而EZH2在AML是否參與EMI的過程及其作用機制如何,目前尚乏研究。為了進一步探究在AML中EZH2與EMI的關系,我們選取高表達EZH2的白血病細胞株kasumi-1作為研究對象,構(gòu)建干擾EZH2表達的載有shRNA的慢病毒載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染kasumi-1細胞,敲除EZH2觀察其增殖、凋亡及遷移等生物學功能的變化并進一步探究EZH2基因影響白血病細胞EMI可能的機制。為防治白血病髓外浸潤的發(fā)生發(fā)展和治療方法提供理論依據(jù)。對象與方法1構(gòu)建質(zhì)粒載體,包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細胞基于siRNA設計原則,針對EZH2基因轉(zhuǎn)錄本共同區(qū)域中的3個靶點我們設計3條shRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。構(gòu)建干擾EZH2的shRNA慢病毒載體,將慢病毒轉(zhuǎn)染白血病細胞株kasum-1,達到穩(wěn)定干擾下調(diào)EZH2的目的。利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后細胞的轉(zhuǎn)染效果并分選出GFP陽性細胞用于體外擴增培養(yǎng)。隨后用QRT-PCR (quantity reverse transcription PCR)和Western Blot (WB)技術(shù)檢測3種shRNAs (siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3)對EZH2的干擾效果,選取干擾效果最好的細胞作為siEZH2實驗組用于后續(xù)實驗研究。2 EZH2對kasumi-1細胞生物學功能的影響實驗中將野生型kasumi-1細胞定義為wild組,轉(zhuǎn)染陰性對照序列的kasumi-1細胞定義為NC組,轉(zhuǎn)染干擾EZH2基因序列的kasumi-1細胞定義為siEZH2組。隨后分別應用熒光定量PCR和Western-Blot檢測上述三組細胞EZH2 mRNA和蛋白的表達,驗證干擾效果。應用CCK8檢測上述三組細胞的增殖活性,運用流式細胞術(shù)檢測三組細胞的凋亡,并運用transwele小室細胞遷移實驗檢測三組細胞的遷移能力。3探究EZH2影響kasumi-1細胞遷移可能的機制結(jié)合參考文獻,運用WB檢測細胞遷移相關信號通路蛋白,如ERK、p-ERK、 c-myc、MMP-2、E-cadherin等的表達,以探究在白血病中EZH2參與EMI可能的分子機制。4統(tǒng)計分析方法運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。以X±s描述資料數(shù)據(jù),三組細胞EZH2 mRNA的比較采用單因素方差分析(One way ANOVA),以P0.05認為具有統(tǒng)計學差異。Levene檢驗方差齊性, P0.05則方差齊,運用LSD方法方法進行三組中兩兩比較；P0.05則方差不齊,則用采用近似F檢驗(Welch方法)代替方差分析后用Dunnett'S T3方法進行三組中兩兩比較.結(jié)果1構(gòu)建質(zhì)粒載體,包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細胞根據(jù)RNAi設計原則,針對EZH2基因的3個靶點設計了3條shRNA序列,將這些序列合成Oligo,連接到相應載體。將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,提取質(zhì)粒,測序驗證。測序結(jié)果表明：上述三種重組載體質(zhì)粒pGFP-shEZH2中shRNA序列與設計的shRNA序列相符,且正確插入到pGFP病毒載體中,可用于后續(xù)實驗。將包裝好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞,倒置熒光顯微鏡下觀轉(zhuǎn)染色48h后kasumi-1細胞熒光表達情況,可見熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。用上述設計好的病毒轉(zhuǎn)染的kasumi-1細胞,72小時在熒光顯微鏡下拍照可見帶有綠色熒光的ksaumi-1。運用流式細胞術(shù)檢測三個不同序列siRNA及空病毒轉(zhuǎn)染后細胞的轉(zhuǎn)染率。其中siRNA-1組的轉(zhuǎn)染率為77.12%,siRNA-2組的轉(zhuǎn)染率為48.78%, siRNA-3組的轉(zhuǎn)染率為71.72%,NC組的轉(zhuǎn)染率為76.41%。隨后應用流式細胞術(shù)從四組中篩選出GFP陽性細胞,體外擴增培養(yǎng)后用于后續(xù)試驗。我們用QRT-PCR及WB驗證了三個不同序列敲除EZH2的效果。siRNA-3組EZH2 mRNA的表達水平為(0.0070+0.0002),siRNA-1組為(0.0096±0.0004),siRNA-2組為(0.0285±0.0031)。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)其中siRNA-3(GGATAGAGAATGTGGGTTT)序列下調(diào)kasumi-1細胞EZH2的表達最為顯著,WB結(jié)果也顯示siRNA-3組下調(diào)效果最明顯,檢測結(jié)果顯示與mRNA一致。因此以siRNA-3組作為siEHZ2組。此外,我們進一步用QRT-PCR和WB檢測了wild組、NC組以及siEZH2組三組之間EZH2的表達水平。siEZH2組EZH2 mRNA的表達水平為(0.0071±0.0002；P0.05),明顯低于wild組(0.1243±0.0074)和NC組(0.1147±0.0091)的水平,P均小于0.000,差異有統(tǒng)計學意義。而wild組與NC組之間比較P=0.135,差異無統(tǒng)計學意義,WB結(jié)果與PCR結(jié)果一致,siEZH2組細胞可用于后續(xù)試驗。2穩(wěn)定下調(diào)EZH2對kasumi-1細胞生物學行為的影響。2.1下調(diào)EZH2對kasumi-1細胞的增殖的影響我們應用CCK-8法檢測wild組,NC組及siEZH2組三組細胞的增殖力。觀察0h,24h,48h,72h以及96h三組細胞的OD情況,結(jié)果顯示siEZH2組OD值在0h和其他兩組比較接近,此后的四個時間點的OD值均小于其他兩組。以時間為橫坐標,細胞存活力為縱坐標作圖,發(fā)現(xiàn)siEZH2組細胞存活力明顯低于其他兩組(P0.05)。說明下調(diào)EZH2后細胞的增殖存活能力下降了。2.2下調(diào)EZH2對kasumi-1細胞凋亡的影響。本研究中我們運用流式細胞術(shù)檢測三組細胞的凋亡能力。流式結(jié)果顯示siEZH2組細胞早期凋亡為(6.23±0.38)%,顯著高于wild組(3.14±0.37)%及NC組(2.90±0.33)%,P值均為0.001,差異有統(tǒng)計學意義：siEZH2的晚期凋亡為(20.77±1.15)%,也顯著高于wild組(3.77±0.36)%及NC組(4.70±0.85)%,P值分別為0.001及0.000,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明下調(diào)EZH2 kasumi-1細胞的凋亡增加了。2.3下調(diào)EZH2對kasumi-1細胞遷移能力的影響。我們應用transwele小室遷移實驗檢測三組細胞的遷移能力。實驗中我們觀察18h遷移到下室的細胞數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組遷移到下室的細胞數(shù)為[(3.50±0.25)%]比wild組[(9.08±0.38)%]和NC組[(9.17±0.38)%]顯著降低,P值均為0.000,蘇木素染色后我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組膜上細胞基數(shù)(26.67±1.53)顯著低于wild組(73.33±3.51)和NC組(72.00±3.00),p值分別為0.000,差異均有統(tǒng)計學意義。小室遷移實驗結(jié)果說明下調(diào)EZH2后kasumi.1細胞的遷移能力也隨之下降。從而說明了EZH2可能與白血病細胞的遷移(EMI)相關。3 EZH2表達調(diào)節(jié)白血病細胞遷移的機制為了進一步了解EZH2調(diào)節(jié)白血病細胞遷移的作用機制,我們應用WB檢測相關蛋白的表達。結(jié)果提示下調(diào)EZH2后EZH2發(fā)揮作用密切相關的蛋白H3K27me3表達量顯著減少,相關的蛋白p-ERK,p-cmyc及MMP-2表達量均顯著減少,而與遷移密切相關的鈣黏連蛋白(E-cadherin)表達量則明顯上調(diào)。ERK, c-myc及APP的表達則基本不變。因此我們EZH2推測EZH2可能通過p-ERK/p-cmyc/MMP2言號通路及E-cadherin影響kasumi-1細胞的遷移能力.結(jié)論1 siRNA慢病毒可穩(wěn)定下調(diào)EZH2的表達,并通過慢病毒細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)獲取穩(wěn)定下調(diào)EZH2表達的kasumi-1細胞株。2在AML中下調(diào)EZH2可促進kasumi-1細胞的凋亡并減弱其增殖能力和遷移能力。3在急性髓系白血病細胞中EZH2可能通過p-ERK/p-cmyc/MMP2信號通路及E-cadherin影響kasumi-1細胞的遷移能力。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

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