本文關(guān)鍵詞：EZH2調(diào)控急性髓系白血病細(xì)胞髓外浸潤(rùn)及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：背景與目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤之一,白血病細(xì)胞在骨髓中無(wú)限增殖和向髓外組織浸潤(rùn),死亡率非常高,盡管近年來(lái)化療方案的不斷改進(jìn)提高了白血病的誘導(dǎo)緩解率,但其復(fù)發(fā)率仍較高。其中的原因之一是白血病髓外浸潤(rùn)。初診AML患者有30～40%可伴有髓外浸潤(rùn)(extramedullary infiltration, EMI),主要臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、齒齦增生、皮膚浸潤(rùn)、肝脾腫大及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯等。有文獻(xiàn)顯示EMI在M4和M5類型(FAB) AML中的發(fā)生率較其他類型高,且伴有EMI的AML患者往往預(yù)后較差,特別是在伴有t(8；21)異常核型的AML患者。作為PRC2催化活性亞基,果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因2 (enhancer of zeste homolog 2, EZH2),起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。它主要通過(guò)對(duì)核小體組蛋白H3K27位點(diǎn)賴氰酸進(jìn)行甲基化修飾,從而沉默抑癌基因、周期蛋白等基因的表達(dá)來(lái)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及腫瘤的形成。大量的研究顯示EZH2在多種惡性實(shí)體腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、腎癌、大腸癌過(guò)表達(dá),而且與腫瘤的侵襲性及較差預(yù)后相關(guān)。目前的研究顯示EZH2在高危的MDS及由其轉(zhuǎn)化而來(lái)的AML中過(guò)表達(dá)與較差預(yù)后相關(guān),還有研究報(bào)道EZH2蛋白在AML患者中的高表達(dá)與LDH異常升高WBC≥50x109及較差預(yù)后顯著相關(guān)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)AML患者EZH2的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,且EZH2 mRNA的表達(dá)與外周白血病細(xì)胞比例顯著正相關(guān)。在不同細(xì)胞株中,U937和KG-1 α細(xì)胞的EZH2基因和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Kasumi-1和HL60細(xì)胞(P0.05),同時(shí)前兩種細(xì)胞的遷移能力也明顯弱于后兩種細(xì)胞。我們推測(cè)EZH2在AML中可能與白血病細(xì)胞EMI有關(guān)。然而EZH2在AML是否參與EMI的過(guò)程及其作用機(jī)制如何,目前尚乏研究。為了進(jìn)一步探究在AML中EZH2與EMI的關(guān)系,我們選取高表達(dá)EZH2的白血病細(xì)胞株kasumi-1作為研究對(duì)象,構(gòu)建干擾EZH2表達(dá)的載有shRNA的慢病毒載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞,敲除EZH2觀察其增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)功能的變化并進(jìn)一步探究EZH2基因影響白血病細(xì)胞EMI可能的機(jī)制。為防治白血病髓外浸潤(rùn)的發(fā)生發(fā)展和治療方法提供理論依據(jù)。對(duì)象與方法1構(gòu)建質(zhì)粒載體,包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞基于siRNA設(shè)計(jì)原則,針對(duì)EZH2基因轉(zhuǎn)錄本共同區(qū)域中的3個(gè)靶點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)3條shRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。構(gòu)建干擾EZH2的shRNA慢病毒載體,將慢病毒轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞株kasum-1,達(dá)到穩(wěn)定干擾下調(diào)EZH2的目的。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒后細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果并分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞用于體外擴(kuò)增培養(yǎng)。隨后用QRT-PCR (quantity reverse transcription PCR)和Western Blot (WB)技術(shù)檢測(cè)3種shRNAs (siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3)對(duì)EZH2的干擾效果,選取干擾效果最好的細(xì)胞作為siEZH2實(shí)驗(yàn)組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2 EZH2對(duì)kasumi-1細(xì)胞生物學(xué)功能的影響實(shí)驗(yàn)中將野生型kasumi-1細(xì)胞定義為wild組,轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的kasumi-1細(xì)胞定義為NC組,轉(zhuǎn)染干擾EZH2基因序列的kasumi-1細(xì)胞定義為siEZH2組。隨后分別應(yīng)用熒光定量PCR和Western-Blot檢測(cè)上述三組細(xì)胞EZH2 mRNA和蛋白的表達(dá),驗(yàn)證干擾效果。應(yīng)用CCK8檢測(cè)上述三組細(xì)胞的增殖活性,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡,并運(yùn)用transwele小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的遷移能力。3探究EZH2影響kasumi-1細(xì)胞遷移可能的機(jī)制結(jié)合參考文獻(xiàn),運(yùn)用WB檢測(cè)細(xì)胞遷移相關(guān)信號(hào)通路蛋白,如ERK、p-ERK、 c-myc、MMP-2、E-cadherin等的表達(dá),以探究在白血病中EZH2參與EMI可能的分子機(jī)制。4統(tǒng)計(jì)分析方法運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以X±s描述資料數(shù)據(jù),三組細(xì)胞EZH2 mRNA的比較采用單因素方差分析(One way ANOVA),以P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Levene檢驗(yàn)方差齊性, P0.05則方差齊,運(yùn)用LSD方法方法進(jìn)行三組中兩兩比較；P0.05則方差不齊,則用采用近似F檢驗(yàn)(Welch方法)代替方差分析后用Dunnett'S T3方法進(jìn)行三組中兩兩比較.結(jié)果1構(gòu)建質(zhì)粒載體,包裝病毒轉(zhuǎn)染kasumi-1細(xì)胞根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則,針對(duì)EZH2基因的3個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了3條shRNA序列,將這些序列合成Oligo,連接到相應(yīng)載體。將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,提取質(zhì)粒,測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明：上述三種重組載體質(zhì)粒pGFP-shEZH2中shRNA序列與設(shè)計(jì)的shRNA序列相符,且正確插入到pGFP病毒載體中,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將包裝好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡下觀轉(zhuǎn)染色48h后kasumi-1細(xì)胞熒光表達(dá)情況,可見熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。用上述設(shè)計(jì)好的病毒轉(zhuǎn)染的kasumi-1細(xì)胞,72小時(shí)在熒光顯微鏡下拍照可見帶有綠色熒光的ksaumi-1。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三個(gè)不同序列siRNA及空病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。其中siRNA-1組的轉(zhuǎn)染率為77.12%,siRNA-2組的轉(zhuǎn)染率為48.78%, siRNA-3組的轉(zhuǎn)染率為71.72%,NC組的轉(zhuǎn)染率為76.41%。隨后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)從四組中篩選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞,體外擴(kuò)增培養(yǎng)后用于后續(xù)試驗(yàn)。我們用QRT-PCR及WB驗(yàn)證了三個(gè)不同序列敲除EZH2的效果。siRNA-3組EZH2 mRNA的表達(dá)水平為(0.0070+0.0002),siRNA-1組為(0.0096±0.0004),siRNA-2組為(0.0285±0.0031)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中siRNA-3(GGATAGAGAATGTGGGTTT)序列下調(diào)kasumi-1細(xì)胞EZH2的表達(dá)最為顯著,WB結(jié)果也顯示siRNA-3組下調(diào)效果最明顯,檢測(cè)結(jié)果顯示與mRNA一致。因此以siRNA-3組作為siEHZ2組。此外,我們進(jìn)一步用QRT-PCR和WB檢測(cè)了wild組、NC組以及siEZH2組三組之間EZH2的表達(dá)水平。siEZH2組EZH2 mRNA的表達(dá)水平為(0.0071±0.0002；P0.05),明顯低于wild組(0.1243±0.0074)和NC組(0.1147±0.0091)的水平,P均小于0.000,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而wild組與NC組之間比較P=0.135,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,WB結(jié)果與PCR結(jié)果一致,siEZH2組細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。2穩(wěn)定下調(diào)EZH2對(duì)kasumi-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。2.1下調(diào)EZH2對(duì)kasumi-1細(xì)胞的增殖的影響我們應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)wild組,NC組及siEZH2組三組細(xì)胞的增殖力。觀察0h,24h,48h,72h以及96h三組細(xì)胞的OD情況,結(jié)果顯示siEZH2組OD值在0h和其他兩組比較接近,此后的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均小于其他兩組。以時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞存活力為縱坐標(biāo)作圖,發(fā)現(xiàn)siEZH2組細(xì)胞存活力明顯低于其他兩組(P0.05)。說(shuō)明下調(diào)EZH2后細(xì)胞的增殖存活能力下降了。2.2下調(diào)EZH2對(duì)kasumi-1細(xì)胞凋亡的影響。本研究中我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡能力。流式結(jié)果顯示siEZH2組細(xì)胞早期凋亡為(6.23±0.38)%,顯著高于wild組(3.14±0.37)%及NC組(2.90±0.33)%,P值均為0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：siEZH2的晚期凋亡為(20.77±1.15)%,也顯著高于wild組(3.77±0.36)%及NC組(4.70±0.85)%,P值分別為0.001及0.000,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明下調(diào)EZH2 kasumi-1細(xì)胞的凋亡增加了。2.3下調(diào)EZH2對(duì)kasumi-1細(xì)胞遷移能力的影響。我們應(yīng)用transwele小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)中我們觀察18h遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為[(3.50±0.25)%]比wild組[(9.08±0.38)%]和NC組[(9.17±0.38)%]顯著降低,P值均為0.000,蘇木素染色后我們發(fā)現(xiàn)siEZH2組膜上細(xì)胞基數(shù)(26.67±1.53)顯著低于wild組(73.33±3.51)和NC組(72.00±3.00),p值分別為0.000,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明下調(diào)EZH2后kasumi.1細(xì)胞的遷移能力也隨之下降。從而說(shuō)明了EZH2可能與白血病細(xì)胞的遷移(EMI)相關(guān)。3 EZH2表達(dá)調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞遷移的機(jī)制為了進(jìn)一步了解EZH2調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞遷移的作用機(jī)制,我們應(yīng)用WB檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示下調(diào)EZH2后EZH2發(fā)揮作用密切相關(guān)的蛋白H3K27me3表達(dá)量顯著減少,相關(guān)的蛋白p-ERK,p-cmyc及MMP-2表達(dá)量均顯著減少,而與遷移密切相關(guān)的鈣黏連蛋白(E-cadherin)表達(dá)量則明顯上調(diào)。ERK, c-myc及APP的表達(dá)則基本不變。因此我們EZH2推測(cè)EZH2可能通過(guò)p-ERK/p-cmyc/MMP2言號(hào)通路及E-cadherin影響kasumi-1細(xì)胞的遷移能力.結(jié)論1 siRNA慢病毒可穩(wěn)定下調(diào)EZH2的表達(dá),并通過(guò)慢病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)獲取穩(wěn)定下調(diào)EZH2表達(dá)的kasumi-1細(xì)胞株。2在AML中下調(diào)EZH2可促進(jìn)kasumi-1細(xì)胞的凋亡并減弱其增殖能力和遷移能力。3在急性髓系白血病細(xì)胞中EZH2可能通過(guò)p-ERK/p-cmyc/MMP2信號(hào)通路及E-cadherin影響kasumi-1細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.71

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