發(fā)布時間：2017-11-13 05:31

  本文關(guān)鍵詞：ROS在白藜蘆醇誘導人結(jié)腸癌HCT116細胞自噬中的作用

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【摘要】：目的:探討白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)誘導人結(jié)腸癌細胞HCT116自噬過程中,ROS發(fā)揮的作用。同時研究RSV誘導細胞自噬過程中ROS、p53、NQO1等的相關(guān)性及其相互調(diào)節(jié),以了解ROS在RSV誘導結(jié)腸癌細胞自噬中的調(diào)節(jié)機制,從而為白藜蘆醇治療結(jié)腸癌的研究提供充分可靠的理論支持。方法:1用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細胞,待其生長至培養(yǎng)皿的80%左右時,應(yīng)用ROS清除劑(NAC)預(yù)先對其進行處理1h,再用不同劑量的白藜蘆醇處理細胞24h后,用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和數(shù)量的變化。其中培養(yǎng)基含有10%的澳洲胎牛血清。2運用MTT法檢測藥物處理細胞后的生存率的改變。同時運用NBB法檢測NAC與白藜蘆醇共同處理組和只加白藜蘆醇組細胞生存率變化的比較。3應(yīng)用單丹磺酰戊二胺(MDC)法檢測藥物處理細胞后的酸性自噬泡的變化。4應(yīng)用DAPI染色法檢測不同藥物處理細胞后的細胞核和染色質(zhì)的變化。5不同藥物處理HCT116細胞和SIRNA技術(shù)沉默p53后,Western blot法檢測后,自噬相關(guān)蛋白以及p53,NQO1,Nrf2等蛋白的表達情況。6流式細胞術(shù)法檢測不同劑量的白藜蘆醇和雙香豆素作用細胞24h后的ROS變化趨勢。7應(yīng)用SPSS13.0處理實驗過程中的多次重復和對照的結(jié)果,且均采用t檢驗的方法分析,最后的實驗結(jié)果會以均數(shù)±標準差的形式表示,如果P0.05則說明具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1首先用不同劑量藥物(0-200μM)作用于HCT116細胞后,MTT的結(jié)果顯示細胞的存活率會隨著藥物濃度的升高而減低。此外,在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),不同劑量的藥物(0-150μM)處理HCT116細胞24h后,隨著藥物劑量的增加,細胞也會隨之發(fā)生變化。主要表現(xiàn)為鏡下細胞的觸角逐漸減少,相互之間的空隙增大,數(shù)目越來越少。同樣,100μM白藜蘆醇作用于人結(jié)腸癌細胞HCT116不同的時間(0,12,24,48h)后,細胞形態(tài)和數(shù)量的改變與濃度組的改變趨勢基本相同。2應(yīng)用DAPI法和Western Blot法檢測濃度組和時間組的細胞后,發(fā)現(xiàn)細胞并沒有明顯的凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過MDC試劑染色發(fā)現(xiàn),不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后,隨著白藜蘆醇劑量的增加,自噬泡的數(shù)量也會隨之增多。同時運用Western Blot法對自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達均隨著藥物劑量的增加而升高,同時抗凋亡有關(guān)的蛋白bcl-2和凋亡有關(guān)的Bax也是呈升高趨勢,且bcl-2/Bax的比值在一定范圍內(nèi)也是有升高趨勢的。此外,應(yīng)用白藜蘆醇處理HCT116不同時間(0,12,24,48h)后,發(fā)現(xiàn)細胞自噬現(xiàn)象與不同劑量組的自噬現(xiàn)象基本相同。這些結(jié)果都提示了HCT116細胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象的出現(xiàn)。3流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后,隨著藥物劑量的增加,ROS的總體含量也會隨之升高。4經(jīng)過NBB法檢測顯示,白藜蘆醇與NAC共同處理細胞組和白藜蘆醇組的細胞都會受到白藜蘆醇劑量的影響,細胞生存率均下降,但是兩種藥物共同處理組的生存率會高于白藜蘆醇組的細胞生存率。倒置顯微鏡觀察顯示,兩種藥物共同處理組的細胞存活數(shù)多于白藜蘆醇組的細胞數(shù)。5經(jīng)過MDC試劑染色發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇與NAC共同處理細胞后,自噬泡數(shù)量比白藜蘆醇組的自噬泡數(shù)量要少。Western Blot法檢測,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與NAC共同處理細胞后,各個蛋白的表達量均會低于白藜蘆醇組的表達量。6經(jīng)過Western Blot法觀察,ROS清除劑(NAC)、p53激動劑(Nutlin-3)、抑制劑(PFT-α)和NQO1活性抑制劑(雙香豆素)分別和白藜蘆醇一起處理HCT116后,NAC、PFT-α和雙香豆素組的蛋白表達量顯著低于白藜蘆醇組蛋白的表達量,Nutlin-3組的蛋白表達量會高于白藜蘆醇組的蛋白表達量,雙香豆素組的LC3和Beclin-1蛋白表達量明顯高于白藜蘆醇組蛋白的表達量。結(jié)論:1白藜蘆醇能夠明顯的抑制體外培養(yǎng)的HCT116的生長,并且這種抑制作用與藥物的劑量和作用時間有明顯的關(guān)聯(lián)。2白藜蘆醇能夠在一定濃度和時間范圍內(nèi)誘導HCT116自噬的發(fā)生,并且ROS在其中發(fā)揮了一定作用。3 NQO1、Nrf2等氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白可以與p53相互調(diào)節(jié)影響細胞內(nèi)的ROS水平,來影響細胞自噬,同時細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)可以通過影響p53來調(diào)控細胞自噬。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

【共引文獻】

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：1179320