本文關(guān)鍵詞：ROS在白藜蘆醇誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬中的作用

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【摘要】：目的:探討白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116自噬過(guò)程中,ROS發(fā)揮的作用。同時(shí)研究RSV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程中ROS、p53、NQO1等的相關(guān)性及其相互調(diào)節(jié),以了解ROS在RSV誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬中的調(diào)節(jié)機(jī)制,從而為白藜蘆醇治療結(jié)腸癌的研究提供充分可靠的理論支持。方法:1用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,待其生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%左右時(shí),應(yīng)用ROS清除劑(NAC)預(yù)先對(duì)其進(jìn)行處理1h,再用不同劑量的白藜蘆醇處理細(xì)胞24h后,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化。其中培養(yǎng)基含有10%的澳洲胎牛血清。2運(yùn)用MTT法檢測(cè)藥物處理細(xì)胞后的生存率的改變。同時(shí)運(yùn)用NBB法檢測(cè)NAC與白藜蘆醇共同處理組和只加白藜蘆醇組細(xì)胞生存率變化的比較。3應(yīng)用單丹磺酰戊二胺(MDC)法檢測(cè)藥物處理細(xì)胞后的酸性自噬泡的變化。4應(yīng)用DAPI染色法檢測(cè)不同藥物處理細(xì)胞后的細(xì)胞核和染色質(zhì)的變化。5不同藥物處理HCT116細(xì)胞和SIRNA技術(shù)沉默p53后,Western blot法檢測(cè)后,自噬相關(guān)蛋白以及p53,NQO1,Nrf2等蛋白的表達(dá)情況。6流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)不同劑量的白藜蘆醇和雙香豆素作用細(xì)胞24h后的ROS變化趨勢(shì)。7應(yīng)用SPSS13.0處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的多次重復(fù)和對(duì)照的結(jié)果,且均采用t檢驗(yàn)的方法分析,最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,如果P0.05則說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1首先用不同劑量藥物(0-200μM)作用于HCT116細(xì)胞后,MTT的結(jié)果顯示細(xì)胞的存活率會(huì)隨著藥物濃度的升高而減低。此外,在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),不同劑量的藥物(0-150μM)處理HCT116細(xì)胞24h后,隨著藥物劑量的增加,細(xì)胞也會(huì)隨之發(fā)生變化。主要表現(xiàn)為鏡下細(xì)胞的觸角逐漸減少,相互之間的空隙增大,數(shù)目越來(lái)越少。同樣,100μM白藜蘆醇作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116不同的時(shí)間(0,12,24,48h)后,細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的改變與濃度組的改變趨勢(shì)基本相同。2應(yīng)用DAPI法和Western Blot法檢測(cè)濃度組和時(shí)間組的細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞并沒(méi)有明顯的凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)MDC試劑染色發(fā)現(xiàn),不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后,隨著白藜蘆醇劑量的增加,自噬泡的數(shù)量也會(huì)隨之增多。同時(shí)運(yùn)用Western Blot法對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)均隨著藥物劑量的增加而升高,同時(shí)抗凋亡有關(guān)的蛋白bcl-2和凋亡有關(guān)的Bax也是呈升高趨勢(shì),且bcl-2/Bax的比值在一定范圍內(nèi)也是有升高趨勢(shì)的。此外,應(yīng)用白藜蘆醇處理HCT116不同時(shí)間(0,12,24,48h)后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象與不同劑量組的自噬現(xiàn)象基本相同。這些結(jié)果都提示了HCT116細(xì)胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象的出現(xiàn)。3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后,隨著藥物劑量的增加,ROS的總體含量也會(huì)隨之升高。4經(jīng)過(guò)NBB法檢測(cè)顯示,白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞組和白藜蘆醇組的細(xì)胞都會(huì)受到白藜蘆醇劑量的影響,細(xì)胞生存率均下降,但是兩種藥物共同處理組的生存率會(huì)高于白藜蘆醇組的細(xì)胞生存率。倒置顯微鏡觀察顯示,兩種藥物共同處理組的細(xì)胞存活數(shù)多于白藜蘆醇組的細(xì)胞數(shù)。5經(jīng)過(guò)MDC試劑染色發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞后,自噬泡數(shù)量比白藜蘆醇組的自噬泡數(shù)量要少。Western Blot法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞后,各個(gè)蛋白的表達(dá)量均會(huì)低于白藜蘆醇組的表達(dá)量。6經(jīng)過(guò)Western Blot法觀察,ROS清除劑(NAC)、p53激動(dòng)劑(Nutlin-3)、抑制劑(PFT-α)和NQO1活性抑制劑(雙香豆素)分別和白藜蘆醇一起處理HCT116后,NAC、PFT-α和雙香豆素組的蛋白表達(dá)量顯著低于白藜蘆醇組蛋白的表達(dá)量,Nutlin-3組的蛋白表達(dá)量會(huì)高于白藜蘆醇組的蛋白表達(dá)量,雙香豆素組的LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量明顯高于白藜蘆醇組蛋白的表達(dá)量。結(jié)論:1白藜蘆醇能夠明顯的抑制體外培養(yǎng)的HCT116的生長(zhǎng),并且這種抑制作用與藥物的劑量和作用時(shí)間有明顯的關(guān)聯(lián)。2白藜蘆醇能夠在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)誘導(dǎo)HCT116自噬的發(fā)生,并且ROS在其中發(fā)揮了一定作用。3 NQO1、Nrf2等氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白可以與p53相互調(diào)節(jié)影響細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,來(lái)影響細(xì)胞自噬,同時(shí)細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)可以通過(guò)影響p53來(lái)調(diào)控細(xì)胞自噬。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.35

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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5 高利飛;miR-224及miR-378e在大腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

6 吳銳榮;miR-SNP與結(jié)直腸癌易感性及化療療效相關(guān)性研究[D];蘇州大學(xué);2014年

7 原寧;結(jié)直腸腺瘤中醫(yī)虛實(shí)證候miRNA表達(dá)譜的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1179320