本文關(guān)鍵詞：端粒酶基因多態(tài)性與肝細(xì)胞性肝癌預(yù)后的相關(guān)性分析

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【摘要】：背景與目的原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見的惡性腫瘤,90%以上的原發(fā)性肝癌都為肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)。在中國,HCC居全部癌癥發(fā)病率中的第2位。全球HCC為癌癥死亡率的第一位。HCC的預(yù)后較差,即使早期或者腫瘤3cm行手術(shù)切除的病人5年的生存率也只有47%到53%,2年的腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)55%。隨著腫瘤基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展,越來越多的學(xué)者更加關(guān)注分子水平危險因素對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、生存時間等預(yù)后的影響,以期更早制定干預(yù)措施,提高肝癌患者生存率。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,能利用自身RNA為模板從頭合成DNA序列,彌補(bǔ)端粒DNA在復(fù)制中的丟失,解決末端復(fù)制問題,維持端粒長度的穩(wěn)定,賦予細(xì)胞無限增殖的能力。端粒失功能或端粒酶激活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制,端粒酶基因變異有可能參與到這些機(jī)制中,促進(jìn)腫瘤發(fā)生或?qū)δ[瘤發(fā)生起保護(hù)作用。因此,可以假設(shè)：端粒酶基因變異可能導(dǎo)致端粒酶表達(dá)異常、表達(dá)調(diào)節(jié)異常或端粒酶活性異常,進(jìn)而改變端粒長度與功能,影響腫瘤發(fā)展及預(yù)后。本研究目的為：通過對HCC患者癌組織樣本中端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)多態(tài)性的分析,探討這些基因位點(diǎn)變異對肝癌患者手術(shù)治療后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、死亡結(jié)局的影響,為肝癌患者預(yù)后分析與干預(yù)提供臨床應(yīng)用基礎(chǔ)信息。方法1.研究對象的收集與隨訪：收集昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院就診并病理明確診斷的肝癌患者共84例,收集患者的性別、年齡、腫瘤家族史、乙肝病毒兩對半、丙肝病毒抗體、巴塞羅那肝癌分期、治療措施類型(包括手術(shù)切除、酒精注射／射頻、化療栓塞等)等基本信息,電話隨訪患者的術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡等情況,隨訪時間為2006年7月1日-2015年1月30日。2.選擇AS-PCR方法進(jìn)行HCC組織樣本中端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)多態(tài)性的檢測。自主設(shè)計引物,組建并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件,構(gòu)建出適用于端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)多態(tài)性檢測的10個AS-PCR檢測體系,并通過PCR產(chǎn)物測序分析驗證其檢測結(jié)果的正確性。3.用經(jīng)驗證后的AS-PCR方法,對HCC組織樣本進(jìn)行端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測并分析其等位基因和基因型頻率的分布規(guī)律。4.用COX回歸分析方法分析端粒酶基因5個SNP基因與多態(tài)性與預(yù)后相關(guān)性,探討其在肝細(xì)胞性肝癌患者預(yù)后中的作用。結(jié)果1.84例研究對象中,男性69例,女性15例,平均年齡為49歲,最大為77歲,最小為31歲。獲得隨訪信息的病例有53例；其肝癌組織成功提取DNA病例有59例；既有隨訪病例也有基因多態(tài)性分析的病例有41例,其中,男性33例,女性8例,到隨訪結(jié)束時,出現(xiàn)死亡的病例13例,術(shù)后復(fù)發(fā)5例,轉(zhuǎn)移6例,刪失值17例。2.AS-PCR優(yōu)化結(jié)果,最適退火溫度分別為：SNP位點(diǎn)rs2735940為53℃,rs2736100為61℃,rs2736098為63℃,rs35719940為62.8℃,rs2293607為66.3℃；采用濃度20μm作為最適引物濃度；選擇TaqDNA聚合酶0.25μl(1.25U)為最適酶濃度,成功構(gòu)建了分別針對野生型引物和突變型引物的AS-PCR反應(yīng)體系和針對端粒酶基因每個SNP位點(diǎn)引物的退火條件。自主構(gòu)建的AS-PCR方法對端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)多態(tài)性檢測結(jié)果與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析結(jié)果一致3.59例HCC組織成功提取DNA的患者中,其癌組織樣本端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)基因突變頻率在42%-60%之間。野生基因型頻率在2.4%-24.2%,雜合基因型占51.2%-97.6%；突變純合基因型頻率為0%-34.2%,其中位點(diǎn)rs2736098和rs35719940沒有檢測到突變純合基因型患者。4.到隨訪截止期,既有隨訪病例也有基因多態(tài)性分析的41例HCC患者平均生存時間為24個月,生存率隨著隨訪時間增加而逐漸下降。COX回歸分析結(jié)果顯示,以死亡為結(jié)局時,SNP位點(diǎn)rs2735940基因突變對死亡的回歸系數(shù)p為2.044,p=0.018(0.05),具有統(tǒng)計學(xué)意義,相對危險度(Exp(B))為7.720,95.0% CI為1.427-41.757。5.端粒酶基因SNP位點(diǎn)rs2735940分別與性別、年齡、家族史、巴塞羅那分期和治療措施進(jìn)行兩因素COX回歸分析,結(jié)果顯示：①rs2735940位點(diǎn)突變與巴塞羅那分期同時分析時,其回歸系數(shù)p分別為1.164和0.991,相對危險度(Exp(B))分別為3.204(95.0% CI為0.854-12.022)和2.693(95.0% CI為1.321-5.492),p值分別為0.084和0.006,僅巴塞羅那分期的回歸系數(shù)p具有統(tǒng)計學(xué)意義；②rs2735940與治療措施同時分析時,其回歸系數(shù)β分別為1.882和-1.631,相對危險度(Exp(B))分別為3.651(95.0% CI為0.916-14.501)和0.196(95.0% CI為0.054-0.704),p值分別為0.067和0.013,僅治療措施具有統(tǒng)計學(xué)意義。③rs2735940位點(diǎn)突變分別與性別、年齡、家族史的兩因素回歸分析顯示,僅有rs2735940位點(diǎn)突變的回歸系數(shù)(p分別為5.746、2.656、6.564)的有統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0.010、0.007、0.004),而性別、年齡、家族史回歸系數(shù)(β分別為0.012、0.977、0.685)的無統(tǒng)計學(xué)意義(p值分別為0.695、0.354、0.396)。結(jié)論1.本研究中自主構(gòu)建的端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)突變AS-PCR檢測方法中引物是可用的,且有特異性的。2.本研究中自主構(gòu)建的端粒酶基因5個SNP位點(diǎn)突變AS-PCR檢測方法,檢測結(jié)果可靠,經(jīng)濟(jì)適用,操作簡便,有臨床推廣應(yīng)用前景。3端粒酶基因啟動子區(qū)域rs2735940 3677位點(diǎn)T→C突變增加了患者術(shù)后死亡的風(fēng)險。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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