本文關(guān)鍵詞：HIF-2α—SCD1通路在低氧誘導肝癌細胞生物學行為中作用的研究

  更多相關(guān)文章： 肝癌細胞 低氧 低氧誘導因子-2α 硬脂酰輔酶A去飽和酶-1

【摘要】：背景與目的肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的、也是發(fā)病率和死亡率最高的消化道惡性腫瘤之一,嚴重威脅人們的健康。因此,探索肝癌細胞生物學行為的發(fā)生機制,為HCC尋求有效的治療途徑十分必要。大多數(shù)癌細胞內(nèi)存在著相對低氧的微環(huán)境。低氧誘導因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)是細胞氧信號途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)歸及預后密切相關(guān)。HIF-2α在腎癌、肝癌等腫瘤中高表達,它能通過啟動其下游靶基因,而導致腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲力增強,加速疾病惡化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境下HIF-2α通過促進脂質(zhì)分化相關(guān)蛋白表達,導致人正常肝細胞株LO2細胞發(fā)生脂肪變性。然而,有關(guān)HIF-2α能否通過調(diào)控肝癌細胞脂質(zhì)代謝進而影響肝癌細胞生物學行為的研究,目前尚無報道。癌細胞的低氧環(huán)境加劇細胞內(nèi)脂質(zhì)合成。硬脂酰輔酶A去和酶1(Stearoyl-Co A desaturase-1,SCD1)是催化多元不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)合成的關(guān)鍵酶。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),SCD1在肝癌中高表達,它可通過抑制腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase,ampk)負性調(diào)節(jié)肝癌細胞自噬以及細胞凋亡、促生存,而影響肝癌的形成及發(fā)展。但是,scd1在肝癌細胞中表達升高的機制尚不清,低氧環(huán)境下是否通過hif-2α介導其表達,未見相關(guān)研究報道。鑒于此,本研究首先觀察低氧環(huán)境下hepg2、smmc-7721肝癌細胞株hif-2ɑ、scd1表達水平;在此基礎上,使用hif-2α下調(diào)質(zhì)粒及scd1小分子抑制劑cay10566,探討hif-2α是否通過調(diào)控scd1表達,而影響肝癌細胞生物學行為,為hcc的發(fā)病機制提供新證據(jù)和潛在治療靶點。方法:一、低氧誘導下肝癌細胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系:1.細胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液和dmem培養(yǎng)液分別培養(yǎng)smmc-7721和hepg2細胞。2.低氧誘導肝癌細胞hif-2α和scd1蛋白表達時間譜:1%o2刺激hepg2和smmc-7721細胞0、3、6、12、24h,收集各時間點細胞并提取總蛋白,用westernblot(wb)法檢測各時間點肝癌細胞hif-2α及scd1蛋白表達水平。3.篩選shrna-hif-2α質(zhì)粒:設置空白、陰性質(zhì)粒、shrna-hif-2αa-d質(zhì)粒,按照shrna-hif-2α質(zhì)粒的使用說明,在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后,用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光強度,用wb檢測hif-2α蛋白表達水平,以篩選抑制效果最佳的shrna-hif-2α質(zhì)粒。4.低氧下肝癌細胞hif-2α和scd1的調(diào)控關(guān)系:根據(jù)上述實驗結(jié)果,選取12h為smmc-7721和hepg2細胞的最佳低氧誘導時間點;參照前期研究,用10μmscd1小分子抑制劑cay10566處理肝癌細胞24h[1]。分為以下幾組:空白組(無任何處理)、低氧組(1%o212h)、低氧陰性對照組(hif-2α陰性質(zhì)粒+1%o212h)、低氧干擾組(hif-2α干擾質(zhì)粒+1%o212h)、低氧cay組(cay1056610μm+1%o212h)、低氧干擾+cay組(hif-2α干擾質(zhì)粒+cay1056610μm+1%o212h),wb檢測各組肝癌細胞hif-2α及scd1蛋白表達變化。二、低氧下hif-2α—scd1通路對hepg2和smmc-7721細胞生物學行為的影響:cck8技術(shù)檢測各組細胞增殖情況,流式細胞術(shù)annexin-v/pe法檢測各組細胞凋亡情況,侵襲小室實驗檢測各組細胞侵襲能力。結(jié)果:一、低氧誘導下肝癌細胞細胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系1、低氧誘導肝癌細胞hif-2α和scd1蛋白表達時間譜:隨著低氧誘導時間延長(0h、3h、6h、12h、24h),hepg2和smmc-7721細胞hif-2α和scd1蛋白表達均呈時間依賴性增加(p0.05)。其中,smmc-7721細胞于低氧刺激12h時,hif-2α蛋白表達水平升高至平臺期。因此,后續(xù)實驗以12h為smmc-7721和hepg2細胞的最佳低氧誘導時間點。2、篩選shrna-hif-2α質(zhì)粒:在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞72h后,各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達90%左右;wb結(jié)果顯示,與空白對比,shrna-hif-2αc質(zhì)粒抑制肝癌細胞hif-2α蛋白表達的效果最佳(p0.05)。3、低氧下肝癌細胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系:wb結(jié)果顯示,低氧環(huán)境下抑制hif-2α表達后,兩種肝癌細胞表達scd1蛋白水平均明顯降低(p0.05);而抑制scd1表達,對肝癌細胞hif-2α蛋白表達無明顯影響(p0.05);同時抑制hif-2α和scd1表達,肝癌細胞表達scd1蛋白減少程度較單獨抑制hif-2α或scd1的更為明顯(p0.05)。提示低氧條件下hif-2α對肝癌細胞scd1的表達具有一定調(diào)控作用。二、低氧下hif-2α—scd1通路對hepg2和smmc-7721細胞生物學行為的影響1、cck8檢測肝癌細胞增殖情況:與空白組比較,低氧組、低氧陰性組hepg2和smmc-7721細胞增殖率升高(p0.05);低氧環(huán)境下抑制hif-2α或scd1表達,hepg2、smmc-7721細胞增殖率較低氧組明顯降低(p0.05);同時抑制hif-2α和scd1表達,兩種肝癌細胞增殖率較低氧組、低氧干擾組及低氧cay組均明顯減少(p0.05)。低氧組與低氧陰性對照組差異不具顯著性(p0.05)。2、流式細胞術(shù)annexin-v/pe法檢測肝癌細胞凋亡改變:與空白組比較,hepg2、smmc-7721細胞低氧組及低氧陰性對照細胞凋亡率減少;低氧環(huán)境下抑制hif-2α或scd1表達,hepg2、smmc-7721細胞凋亡率較低氧組和低氧陰性對照組明顯升高(p0.05);同時抑制hif-2α和scd1表達,兩種肝癌細胞凋亡率較低氧組、低氧干擾組及低氧cay組均明顯增多(p0.05)。低氧組與低氧陰性對照組差異不具顯著性(P0.05)。3、Transwell檢測肝癌細胞侵襲改變:與空白組比較,低氧組和低氧陰性對照組HepG2和SMMC-7721細胞侵襲指數(shù)提高。低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達,HepG2、SMMC-7721細胞侵襲指數(shù)較低氧組明顯降低(P0.05);同時抑制HIF-2α和SCD1表達,兩種肝癌細胞侵襲能力較低氧組、低氧干擾組及低氧CAY組均明顯減少(P0.05)。低氧組與低氧陰性對照組差異不具顯著性(P0.05)。結(jié)論:1、低氧誘導肝癌細胞HIF-2α及SCD1蛋白表達水平上調(diào)。2、低氧可能通過HIF-2α—SCD1途徑調(diào)控肝癌細胞能量代謝,進而影響其生物學行為。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳軍;王良興;;低氧誘導的蛋白表達研究進展[J];醫(yī)學綜述;2006年15期

2 馬子敏,楊曦明,洪欣,孫興斌,謝印芝;低氧誘導法培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2000年05期

3 陳偉,陳家佩;低氧誘導促紅細胞生成素基因表達的機制[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);2000年06期

4 吳鋼,郝亞榮,李庚山,黃從新,王晶,謝強,黃崢嶸;低氧誘導心肌細胞表達血管內(nèi)皮生長因子發(fā)生機制的實驗研究[J];微循環(huán)學雜志;2004年01期

5 王慶華，韓沾元，陳銘，聞萍;急性低氧誘導大鼠皮層和海馬區(qū)自由基增殖[J];生理學報;1995年05期

6 殷愛紅;武文琦;何麗明;鄭少鵬;;低氧誘導人VEGF基因表達載體的構(gòu)建及其蛋白表達檢測[J];山東醫(yī)藥;2011年52期

7 敖啟林;朱朋成;葛小娜;盧瑋;何惠華;;低氧誘導肺動脈內(nèi)皮細胞間質(zhì)細胞衍生因子-1的表達及其調(diào)控機制[J];中華病理學雜志;2006年09期

8 彭敏戀;戴愛國;蔣永亮;譚永麗;;低氧誘導豬肺動脈內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的鑒定及其生物學意義[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2013年04期

9 吳煥明,尹為華;丹參酮Ⅱ-A硫酸鈉對低氧誘導肺血管平滑肌細胞增殖的影響[J];同濟醫(yī)科大學學報;2001年02期

10 胡娟;鄧貴福;胡媛Y，

本文編號：1171607