發(fā)布時(shí)間：2017-11-11 13:31

  本文關(guān)鍵詞：HIF-2α—SCD1通路在低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為中作用的研究

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【摘要】：背景與目的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的、也是發(fā)病率和死亡率最高的消化道惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人們的健康。因此,探索肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的發(fā)生機(jī)制,為HCC尋求有效的治療途徑十分必要。大多數(shù)癌細(xì)胞內(nèi)存在著相對(duì)低氧的微環(huán)境。低氧誘導(dǎo)因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)是細(xì)胞氧信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)。HIF-2α在腎癌、肝癌等腫瘤中高表達(dá),它能通過(guò)啟動(dòng)其下游靶基因,而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲力增強(qiáng),加速疾病惡化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境下HIF-2α通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)分化相關(guān)蛋白表達(dá),導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞株LO2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。然而,有關(guān)HIF-2α能否通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究,目前尚無(wú)報(bào)道。癌細(xì)胞的低氧環(huán)境加劇細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。硬脂酰輔酶A去和酶1(Stearoyl-Co A desaturase-1,SCD1)是催化多元不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)合成的關(guān)鍵酶。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),SCD1在肝癌中高表達(dá),它可通過(guò)抑制腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase,ampk)負(fù)性調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡、促生存,而影響肝癌的形成及發(fā)展。但是,scd1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)升高的機(jī)制尚不清,低氧環(huán)境下是否通過(guò)hif-2α介導(dǎo)其表達(dá),未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。鑒于此,本研究首先觀察低氧環(huán)境下hepg2、smmc-7721肝癌細(xì)胞株hif-2ɑ、scd1表達(dá)水平;在此基礎(chǔ)上,使用hif-2α下調(diào)質(zhì)粒及scd1小分子抑制劑cay10566,探討hif-2α是否通過(guò)調(diào)控scd1表達(dá),而影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為,為hcc的發(fā)病機(jī)制提供新證據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。方法:一、低氧誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系:1.細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液和dmem培養(yǎng)液分別培養(yǎng)smmc-7721和hepg2細(xì)胞。2.低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞hif-2α和scd1蛋白表達(dá)時(shí)間譜:1%o2刺激hepg2和smmc-7721細(xì)胞0、3、6、12、24h,收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞并提取總蛋白,用westernblot(wb)法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝癌細(xì)胞hif-2α及scd1蛋白表達(dá)水平。3.篩選shrna-hif-2α質(zhì)粒:設(shè)置空白、陰性質(zhì)粒、shrna-hif-2αa-d質(zhì)粒,按照shrna-hif-2α質(zhì)粒的使用說(shuō)明,在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后,用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度,用wb檢測(cè)hif-2α蛋白表達(dá)水平,以篩選抑制效果最佳的shrna-hif-2α質(zhì)粒。4.低氧下肝癌細(xì)胞hif-2α和scd1的調(diào)控關(guān)系:根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取12h為smmc-7721和hepg2細(xì)胞的最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn);參照前期研究,用10μmscd1小分子抑制劑cay10566處理肝癌細(xì)胞24h[1]。分為以下幾組:空白組(無(wú)任何處理)、低氧組(1%o212h)、低氧陰性對(duì)照組(hif-2α陰性質(zhì)粒+1%o212h)、低氧干擾組(hif-2α干擾質(zhì)粒+1%o212h)、低氧cay組(cay1056610μm+1%o212h)、低氧干擾+cay組(hif-2α干擾質(zhì)粒+cay1056610μm+1%o212h),wb檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞hif-2α及scd1蛋白表達(dá)變化。二、低氧下hif-2α—scd1通路對(duì)hepg2和smmc-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:cck8技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)annexin-v/pe法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果:一、低氧誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞細(xì)胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系1、低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞hif-2α和scd1蛋白表達(dá)時(shí)間譜:隨著低氧誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)(0h、3h、6h、12h、24h),hepg2和smmc-7721細(xì)胞hif-2α和scd1蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴(lài)性增加(p0.05)。其中,smmc-7721細(xì)胞于低氧刺激12h時(shí),hif-2α蛋白表達(dá)水平升高至平臺(tái)期。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以12h為smmc-7721和hepg2細(xì)胞的最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)。2、篩選shrna-hif-2α質(zhì)粒:在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞72h后,各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達(dá)90%左右;wb結(jié)果顯示,與空白對(duì)比,shrna-hif-2αc質(zhì)粒抑制肝癌細(xì)胞hif-2α蛋白表達(dá)的效果最佳(p0.05)。3、低氧下肝癌細(xì)胞hif-2α和scd1之間的調(diào)控關(guān)系:wb結(jié)果顯示,低氧環(huán)境下抑制hif-2α表達(dá)后,兩種肝癌細(xì)胞表達(dá)scd1蛋白水平均明顯降低(p0.05);而抑制scd1表達(dá),對(duì)肝癌細(xì)胞hif-2α蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(p0.05);同時(shí)抑制hif-2α和scd1表達(dá),肝癌細(xì)胞表達(dá)scd1蛋白減少程度較單獨(dú)抑制hif-2α或scd1的更為明顯(p0.05)。提示低氧條件下hif-2α對(duì)肝癌細(xì)胞scd1的表達(dá)具有一定調(diào)控作用。二、低氧下hif-2α—scd1通路對(duì)hepg2和smmc-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響1、cck8檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖情況:與空白組比較,低氧組、低氧陰性組hepg2和smmc-7721細(xì)胞增殖率升高(p0.05);低氧環(huán)境下抑制hif-2α或scd1表達(dá),hepg2、smmc-7721細(xì)胞增殖率較低氧組明顯降低(p0.05);同時(shí)抑制hif-2α和scd1表達(dá),兩種肝癌細(xì)胞增殖率較低氧組、低氧干擾組及低氧cay組均明顯減少(p0.05)。低氧組與低氧陰性對(duì)照組差異不具顯著性(p0.05)。2、流式細(xì)胞術(shù)annexin-v/pe法檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡改變:與空白組比較,hepg2、smmc-7721細(xì)胞低氧組及低氧陰性對(duì)照細(xì)胞凋亡率減少;低氧環(huán)境下抑制hif-2α或scd1表達(dá),hepg2、smmc-7721細(xì)胞凋亡率較低氧組和低氧陰性對(duì)照組明顯升高(p0.05);同時(shí)抑制hif-2α和scd1表達(dá),兩種肝癌細(xì)胞凋亡率較低氧組、低氧干擾組及低氧cay組均明顯增多(p0.05)。低氧組與低氧陰性對(duì)照組差異不具顯著性(P0.05)。3、Transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲改變:與空白組比較,低氧組和低氧陰性對(duì)照組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞侵襲指數(shù)提高。低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達(dá),HepG2、SMMC-7721細(xì)胞侵襲指數(shù)較低氧組明顯降低(P0.05);同時(shí)抑制HIF-2α和SCD1表達(dá),兩種肝癌細(xì)胞侵襲能力較低氧組、低氧干擾組及低氧CAY組均明顯減少(P0.05)。低氧組與低氧陰性對(duì)照組差異不具顯著性(P0.05)。結(jié)論:1、低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HIF-2α及SCD1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。2、低氧可能通過(guò)HIF-2α—SCD1途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞能量代謝,進(jìn)而影響其生物學(xué)行為。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1171607