發(fā)布時間：2017-11-10 15:23

  本文關(guān)鍵詞：凋亡抑制蛋白c-FLIP促進(jìn)肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝機(jī)制的研究

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【摘要】：肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,肝癌引起的死亡人數(shù)占到了世界癌癥死亡人口的三分之一,是我國第二大癌癥死亡原因。目前,我國肝癌發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升趨勢,帶來沉重的社會、醫(yī)療和家庭負(fù)擔(dān)。肝癌目前主要的治療方式有手術(shù)切除,肝移植,介入治療,以及放化療。由于近年分子靶向藥物在肝癌中的應(yīng)用,肝癌患者的預(yù)后有了一定程度的改善,但仍需要尋找更有效的肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶點分子。由于肝癌惡性程度高,進(jìn)展迅速,往往發(fā)現(xiàn)較晚,造成腫瘤死亡率很高,在肝癌中通過對肝癌發(fā)生發(fā)展過程中分子調(diào)控機(jī)制的研究,找到特異性的肝癌治療位點,并針對該治療位點開發(fā)肝癌藥物,在肝癌治療中具有重要的意義。凋亡抑制蛋白c-FLIP(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme inhibitory protein)是1997報道發(fā)現(xiàn)的IAP家族中的一個重要成員,是一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制蛋白,在病毒、真核生物、哺乳動物等許多物種中廣泛存在,與炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中,c-FLIP在細(xì)胞外凋亡通路,NF-κB通路,以及自噬和壞死通路中發(fā)揮重要的功能,有證據(jù)顯示,c-FLIP對很多蛋白泛素化過程具有調(diào)節(jié)作用。c-FLIP是在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)腫瘤的增殖,在肝癌組織的中的表達(dá)較癌旁組織中高,與肝癌的預(yù)后具有負(fù)相關(guān)性。腫瘤的惡性增殖離不開能量物質(zhì)的供給和代謝失常,c-FLIP與肝癌細(xì)胞能量代謝是否相關(guān),目前還未見報道。葡萄糖作為細(xì)胞的主要能源物質(zhì),在腫瘤增殖過程中發(fā)揮重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝與正常組織的葡萄糖代謝是不同的。在腫瘤細(xì)胞中,葡萄糖主要通過有氧酵解的方式進(jìn)行代謝,產(chǎn)生大量的乳酸。在腫瘤細(xì)胞中,葡萄糖的攝取明顯高于正常組織,腫瘤細(xì)胞通過過表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運體來滿足自身的葡萄糖需求。在不同的腫瘤細(xì)胞,表達(dá)不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運體。腫瘤葡萄糖代謝的改變主要依賴于細(xì)胞中各種癌基因和抑癌基因的共同作用來實現(xiàn)的。c-FLIP在肝癌中作為一種促進(jìn)腫瘤增殖的分子,是否對腫瘤的葡萄糖代謝具有影響呢?影響機(jī)制是什么?本課題針對上述問題進(jìn)行了深入的探討和研究。目的明確c-FLIP對肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝是否具有影響;闡明c-FLIP調(diào)控細(xì)胞葡萄糖代謝的機(jī)制;分析c-FLIP調(diào)控肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝在肝癌發(fā)生發(fā)展中意義,以及與肝癌的臨床預(yù)后的相關(guān)性。方法1.將c-FLIPL干涉慢病毒感染細(xì)胞,構(gòu)建c-FLIPL特異性干涉的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞;用能量實時檢測儀seahorse XF24 Analyer分析c-FLIPL對肝癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響;在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用熒光標(biāo)記的葡萄糖類似物2-NBDG,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞葡萄糖攝取能力,構(gòu)建小鼠肝癌荷瘤模型,并利用小動物PET-CT分析機(jī)體腫瘤葡萄糖攝取能力,同時在肝癌荷瘤模型中分析c-FLIPL對肝癌增殖的影響。2.通過Western Blot和RT-PCR在蛋白和RNA水平分析c-FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運體的影響;通過蛋白質(zhì)泛素化檢測方法檢測c-FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運體泛素化降解影響;使用免疫共沉淀和間接免疫熒光實驗檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。3.流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞在低糖條件下細(xì)胞的凋亡水平;篩選出對低糖敏感的肝癌細(xì)胞系;分析c-FLIPL對低糖耐受的影響。4.利用免疫組化技術(shù)測定肝癌及癌旁組織中c-FLIPL及其調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達(dá);分析在肝癌中和癌旁組織中的表達(dá)是否具有差異,二者之間的表達(dá)是否具有相關(guān)性;統(tǒng)計分析其表達(dá)與肝癌臨床分期的相關(guān)性。結(jié)果1.c-FLIPL促進(jìn)肝癌細(xì)胞糖酵解,同時在細(xì)胞水平和動物模型中發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖的攝取進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞有氧酵解。我們還發(fā)現(xiàn),在肝癌荷瘤裸鼠動物模型中,c-FLIPL促進(jìn)腫瘤的增殖。2.在肝癌細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)c-FLIPL影響細(xì)胞葡萄糖攝取是通過與SGLT1相互作用,抑制肝癌細(xì)胞中SGLT1蛋白泛素化,抑制SGLT1降解,促進(jìn)肝癌細(xì)胞通過SGLT1主動攝取葡萄糖。3.不同的肝癌細(xì)胞系對低糖的敏感性不同,在肝癌細(xì)胞系Hep G2,MHC-97h,Huh-7,SMMC-7721,BEL-7704中,Hep G2,MHC-97h,Huh-7對低糖耐受,SMMC-7721,BEL-7704對低糖敏感,在對低糖耐受的細(xì)胞中,SGLT1的表達(dá)較敏感細(xì)胞表達(dá)高。提示SGLT1對細(xì)胞低糖耐受起重要的作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過影響SGLT1促進(jìn)細(xì)胞對低糖的耐受。4.我們通過免疫組化檢測c-FLIPL和SGLT1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)c-FLIPL和SGLT1在在肝癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織,統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)c-FLIPL的表達(dá)與SGLT1的表達(dá)具有正相關(guān)性。同時發(fā)現(xiàn),在肝癌中c-FLIPL和SGLT1的表達(dá)與肝癌的臨床分期具有正相關(guān)性。結(jié)論本課題研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過抑制肝癌細(xì)胞葡萄糖主動轉(zhuǎn)運體SGLT1的降解,促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取吸收,促進(jìn)肝癌細(xì)胞對低糖的耐受。在肝癌組織中c-FLIPL與SGLT1表達(dá)高于癌旁組織,且二者表達(dá)具有相關(guān)性,與肝癌的臨床分期正相關(guān),明確了c-FLIPL在肝癌葡萄糖代謝的調(diào)控作用,及SGLT1在肝癌發(fā)展中的意義。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 彭瓊;沈悅海;王冠林;張寬仁;;細(xì)胞存亡調(diào)控蛋白c-FLIP:癌細(xì)胞TRAIL耐受的關(guān)鍵蛋白[J];生命科學(xué);2013年08期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉寧;太白銀蓮花皂苷-A對人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞作用及機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 趙茂鑫;FADD基因?qū)εＢ雅蓊w粒細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用研究[D];吉林大學(xué);2014年

3 閆加美;新型粉防己堿衍生物H1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及自噬的研究[D];山東大學(xué);2014年

4 劉寧;太白銀蓮花皂苷-A對人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞作用及機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

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本文編號：1167214