本文關(guān)鍵詞：CCL2在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)作用的研究

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【摘要】：第一部分CCL2基因慢病毒載體的構(gòu)建目的:構(gòu)建趨化因子配體2(chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2)基因的慢病毒表達(dá)載體,為研究該基因?qū)Π籽〖?xì)胞的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.利用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)技術(shù),擴(kuò)增出CCL2基因的CDS區(qū),與p MD19載體進(jìn)行連接,陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序。2.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒CCL2-PLVX,利用PLVX、PLP-VSVG、plp1、plp2慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng),在293T細(xì)胞中采用磷酸鈣沉淀法包裝CCL2慢病毒后侵染THP-1細(xì)胞,提取基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增CCL2基因。結(jié)果:所獲CCL2基因經(jīng)測(cè)序與Gen Bank比對(duì)序列一致。慢病毒載體質(zhì)粒CCL2-PLVX經(jīng)雙酶切鑒定片段大小正確。包裝的慢病毒顆粒侵染THP-1細(xì)胞后,CCL2基因成功插入細(xì)胞基因組DNA中。結(jié)論:成功構(gòu)建帶有CCL2基因的慢病毒載體,為進(jìn)一步研究CCL2基因?qū)Π籽〖?xì)胞的生物學(xué)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第二部分CCL2基因在白血病細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)及其生物學(xué)功能研究目的:CCL2在白血病細(xì)胞株THP-1穩(wěn)定表達(dá)后,觀察CCL2對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞周期及細(xì)胞耐藥性的影響,初步探討CCL2基因在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)功能。方法:將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成三組:未轉(zhuǎn)染組,空載體轉(zhuǎn)染組以及CCL2轉(zhuǎn)染組。1.CCK-8試劑測(cè)定細(xì)胞活力,繪制生長(zhǎng)曲線,觀察CCL2對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響;2.利用FCM檢測(cè)CCL2對(duì)THP-1細(xì)胞周期的影響3.用2種化療藥物(柔紅霉素、高三尖杉酯堿)作用THP-1細(xì)胞24h,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,觀察CCL2基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊?4.加入100ng/ml濃度的CCL2重組蛋白,觀察CCL2對(duì)THP-1的趨化作用;利用Transwell小室觀察三組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.收集侵襲實(shí)驗(yàn)中上下室的培養(yǎng)上清,Elisa檢測(cè)CCL2蛋白濃度。6.不加/加入100ng/ml濃度的CCL2重組蛋白處理THP-1細(xì)胞24h,收集細(xì)胞做遷移RT2 profiler PCR array實(shí)驗(yàn),初步探討CCL2影響遷移的機(jī)制。結(jié)果:1.CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線,CCL2轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組(空載體載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組,下同)的細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異(P0.05);2.FCM檢測(cè)三組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),CCL2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期無(wú)顯著影響(P0.05);3.加藥結(jié)果顯示,CCL2不影響THP-1細(xì)胞對(duì)柔紅霉素、及高三尖杉酯堿的藥物敏感性;4.通過(guò)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),CCL2重組蛋白可以增強(qiáng)THP-1細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力;CCL2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移能力與對(duì)照組無(wú)明顯差異(9.293±0.302 Vs 9.187±0.526,p=0.77),穿膜能力明顯低于對(duì)照組(1.702±0.537 Vs 0.520±0.255,p=0.026);5.侵襲實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染CCL2組上室CCL2蛋白濃度顯著高于下室(p0.001);6.遷移RT2 profiler PCR array顯示,CCL2重組蛋白處理THP-1細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,EPX、SPP1、CCL2、CX3CL1和CXCL13的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:。1.CCL2定向趨化THP-1細(xì)胞的遷移,高表達(dá)CCL2的細(xì)胞通過(guò)自分泌樣作用使其侵襲能力減弱;2.CCL2的表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖、周期及藥物敏感性無(wú)顯著影響第三部分CCL2干擾對(duì)白血病細(xì)胞的生物學(xué)影響目的:干擾CCL2在白血病細(xì)胞株HL-60的表達(dá)后,觀察CCL2基因?qū)L-60細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響及相關(guān)機(jī)制研究。方法:1.利用慢病毒包裝的方法將干擾效率最高的RNA鏈侵染白血病細(xì)胞株HL-60,驗(yàn)證CCL2基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)。2.將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成三組:未轉(zhuǎn)染組,空載體轉(zhuǎn)染組以及sh-CCL2轉(zhuǎn)染組,使用CCK-8試劑盒測(cè)定三組細(xì)胞活力,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,觀察sh-CCL2對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響;2.通過(guò)FCM分析sh-CCL2對(duì)HL-60細(xì)胞周期的影響;3.利用表達(dá)譜測(cè)序技術(shù),分析CCL2基因穩(wěn)定沉默對(duì)HL-60細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果:1.RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證CCL2表達(dá)水平成功下調(diào)。2.CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線,sh-CCL2轉(zhuǎn)染組的增殖速度明顯低于對(duì)照組(空載體載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組,下同)(p0.01);2.我們采用FCM檢測(cè)三組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),sh-CCL2沉默后細(xì)胞S期含量減少12%,G1期含量增加;3.測(cè)序結(jié)果顯示,CCL2穩(wěn)定沉默細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞間的差異表達(dá)基因共有159個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的基因58個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因101個(gè),涉及細(xì)胞周期、TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NOD樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NF-κB信號(hào)通路等多個(gè)方面,RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證CCL2沉默后,細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:1.RNAi沉默CCL2后,白血病細(xì)胞HL-60增殖速度明顯減慢;2.RNAi沉默CCL2干擾HL-60細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,細(xì)胞內(nèi)cyclin D1的m RNA水平和蛋白水平表達(dá)下降。第四部分CCL2/CCR2基因在急性白血病中的表達(dá)及其臨床意義目的:探討CCL2/CCR2基因在急性白血病(acute leukemia,AL)患者原代骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況及其與AL各項(xiàng)臨床特征的相關(guān)性及預(yù)后意義。方法:病例來(lái)源于2012-2013年期間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診斷和治療的急性白血病患者176例(初診ALL66例,ALL緩解60例,初診AML32例,AML緩解18例),20例同期非急性白血病作為對(duì)照。采用患者的骨髓標(biāo)本分離單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)CCL2和CCR2基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)合臨床資料,分析其在AL中的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性。結(jié)果:1.CCL2及CCR2在疾病的不同病程階段表達(dá)水平不同。在ALL中,CCL2和CCR2的表達(dá)趨勢(shì)一致,即初診組低水平,完全緩解后表達(dá)增高至正常水平(PCCL20.001,PCCR20.001)。在AML中,初診組CCL2的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P0.001),化療后CCL2的表達(dá)水平無(wú)改變(P=0.462);CCR2在AML患者的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)。2.初診AML患者CCL2和CCR2的表達(dá)水平高于初診ALL患者(PCCL2=0.002,PCCR20.001);3.CCL2的表達(dá)水平高低與AL患者臨床特征及早期治療反應(yīng)均無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論:初診ALL患者骨髓幼稚細(xì)胞低表達(dá)CCL2和CCR2,隨著病情緩解而恢復(fù)正常水平。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.7

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本文編號(hào)：1165792