本文關(guān)鍵詞：MiR-367-3p抑制TGF-β誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制

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【摘要】：背景與目的:目前來看肺癌仍是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示肺癌約占男性癌癥死亡率的28%及女性的26%,均居癌癥相關(guān)死亡率的首位。肺癌中又以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)最為多見,約占肺癌總數(shù)的85%。雖然近年來靶向治療的發(fā)展在一定程度上提高了非小細(xì)胞肺癌的治療效果,但五年生存率仍無明顯改善。影響NSCLC預(yù)后的最主要因素是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,研究表明TGF-β在癌癥早期能抑制上皮細(xì)胞增殖起著抑癌作用,而在晚期則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移;體內(nèi)TGF-β含量較高的患者預(yù)后較差。因此對(duì)NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究已成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。MicroRNA發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用通常是通過與特定的靶基因3'UTR種子序列完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)基因沉默或降解的。已經(jīng)有許多研究表明在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中檢測(cè)到了多種microRNAs表達(dá)的改變。我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示多個(gè)microRNAs可以靶向ZEB2的3'UTR區(qū)域的不同種子序列。本研究旨在探討NSCLC中ZEB2異常表達(dá)的microRNA調(diào)控機(jī)制,為NSCLC的早期診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析能夠靶向ZEB2的3'UTR區(qū)域的microRNAs,我們篩選到miR-367-3p。首先運(yùn)用雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-367-3p是否與ZEB2 3'UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合,驗(yàn)證mi R-367-3p對(duì)ZEB2的靶向作用。合成miR-367-3p mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549和H226細(xì)胞,運(yùn)用Real-Time PCR和Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)變化。(2)Real-Time PCR方法分別檢測(cè)在人正常支氣管細(xì)胞HBE和6株NSCLC細(xì)胞以及20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、20例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和60對(duì)NSCLC組織樣本中miR-367-3p和ZEB2基因的mRNA表達(dá)水平。并且將20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、20例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中miR-367-3p和ZEB2基因做差異性表達(dá)對(duì)比分析,將60對(duì)NSCLC樣本組織中的miR-367-3p和ZEB2基因的表達(dá)作回歸分析,統(tǒng)計(jì)出NSCLC中ZEB2和miR-367-3p表達(dá)的相關(guān)性。(3)將miR-367-3p的模擬體mimics轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞株A549和H226中,在加或不加TGF-β刺激下,運(yùn)用Western Blot方法檢測(cè)TGF-β誘導(dǎo)的EMT分子marker:e-cadherin,n-cadherin,vimentin的蛋白表達(dá)情況。運(yùn)用transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。(4)將si-zeb2轉(zhuǎn)染到nsclc細(xì)胞株a549和h226細(xì)胞中將zeb2基因干擾,在加或不加tgf-β刺激下,運(yùn)用westernblot方法檢測(cè)tgf-β誘導(dǎo)的emt分子marker:e-cadherin,n-cadherin,vimentin的蛋白表達(dá)情況。運(yùn)用transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。結(jié)果:(1)通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和在nsclc細(xì)胞中的dualluciferasereporterassay實(shí)驗(yàn)可知mir-367-3p可以結(jié)合在zeb2基因的3'utr區(qū)。nsclc細(xì)胞株a549和h226瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mir-367-3p模擬體mimics,zeb2基因的mrna和蛋白表達(dá)都顯著下降。因此可證明mir-367-3p下調(diào)zeb2基因的mrna和蛋白表達(dá)并且這種作用是通過mir-367-3p與zeb2基因的3'utr種子序列直接結(jié)合引起的。(2)與正常肺上皮細(xì)胞hbe相比nsclc細(xì)胞a549、95c、95d、h1299、h226、和ltep-α-2中zeb2mrna高表達(dá),mir-367-3p低表達(dá)。相比于20例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的nsclc組織,在20例有遠(yuǎn)端淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的nsclc組織中,zeb2基因明顯高表達(dá)但是mir-367-3p的表達(dá)沒有體現(xiàn)出差異性表達(dá)。在60對(duì)nsclc組織樣本中,我們通過癌組織比癌旁組織對(duì)zeb2和mir-367-3p的表達(dá)作回歸分析發(fā)現(xiàn)nsclc中兩者的表達(dá)之間是沒有明顯相關(guān)性的。(3)在nsclc細(xì)胞a549和h226中瞬轉(zhuǎn)mir-367-3pmimics過表達(dá)后,在加或不加tgf-β刺激下,由tgf-β誘導(dǎo)的emt分子marker中,e-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)、n-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)。并且transwell實(shí)驗(yàn)顯示mir-367-3pmimics過表達(dá)后a549和h226細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲能力受到抑制。(4)在nsclc細(xì)胞a549和h226中干擾zeb2后,在加或不加tgf-β刺激下,由tgf-β誘導(dǎo)的emt分子marker中,e-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)、n-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)。并且transwell實(shí)驗(yàn)顯示干擾zeb2基因后a549和h226細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲能力受到抑制。結(jié)論:nsclc中mir-367-3p能夠直接靶向zeb2的3'utr種子序列而沉默zeb2基因的表達(dá)。相比于hbe細(xì)胞,nsclc細(xì)胞中mir-367-3p低表達(dá)而zeb2基因高表達(dá)。nsclc患者組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的nsclc組織樣本中zeb2基因表達(dá)明顯高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的nsclc組織樣本,但是mir-367-3p沒有在兩者之間體現(xiàn)差異性表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證mir-367-3p和zeb2在nsclc組織中表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)兩者并沒有呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性,可能原因第一是由于mir-367-3p的表達(dá)量在nsclc組織中太低,還有就是可能其他mirna或lncrna也參與了對(duì)zeb2和miR-367-3p的調(diào)控作用。但是,miR-367-3p可能是一種抑癌基因,在肺癌的發(fā)生于發(fā)展中,miR-367-3p參與調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中上游轉(zhuǎn)錄因子ZEB2的表達(dá),在抑制TGF-β誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。通過研究mi R-367-3p對(duì)ZEB2基因的抑制作用可能會(huì)有助于提高我們對(duì)NSCLC的致病機(jī)制的了解,進(jìn)而對(duì)NSCLC的診斷和治療提供可靠的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1165204