發(fā)布時間：2017-11-09 23:26

  本文關(guān)鍵詞：乳腺癌干細胞在三陰乳腺癌EMT發(fā)生和血管生成擬態(tài)形成中的作用

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【摘要】：研究背景和目的三陰乳腺癌是乳腺癌的特殊的分子類型,其特點為腫瘤中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(HER-2)均不表達,因缺乏有效的治療靶點,三陰乳腺癌患者的預(yù)后很差。在最近的研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞在三陰乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1,2]。腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是存在于腫瘤細胞中的一種特殊的亞群細胞,腫瘤干細胞數(shù)量稀少,并且具有自我更新以及多向分化的能力,研究證實腫瘤干細胞在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,并影響患者的預(yù)后[3-5]。越來越多的證據(jù)表明,腫瘤干細胞與腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生和血管生成擬態(tài)的形成存在密切的聯(lián)系[6]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是機體正常胚胎發(fā)育及腫瘤轉(zhuǎn)移中重要的過程;腫瘤血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是近年發(fā)現(xiàn)的特殊腫瘤血液微循環(huán)模式,VM不依賴內(nèi)皮細胞,其管腔由腫瘤細胞圍成,并可以在管腔中發(fā)現(xiàn)紅細胞,VM和腫瘤的惡性程度以及轉(zhuǎn)移具有緊密的聯(lián)系。在本課題中我們通過研究腫瘤干細胞在三陰乳腺癌EMT的發(fā)生及VM形成中的機制,從而為三陰乳腺癌的治療尋找新的思路。研究方法一、研究人三陰乳腺癌中腫瘤干細胞同VM的關(guān)系。收集天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院總醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并且隨訪資料完整的100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病理資料100例,以腫瘤干細胞表面標記物CD44、CD24、VM相關(guān)蛋白VE-cadherin為指標,對乳腺癌病理組織切片行免疫組織化學(xué)染色,并進行CD31/PAS雙重染色,觀察并分析含有腫瘤干細胞特異性指標CD44+和CD24—表型的乳腺癌干細胞和患者年齡、腫瘤分級、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移狀況、預(yù)后、是否為三陰乳腺癌、VE-cadherin蛋白表達以及和VM的相關(guān)性。二、腫瘤干細胞對三陰乳腺癌EMT發(fā)生和VM形成影響的體外研究1)常規(guī)培養(yǎng)三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231和非三陰乳腺癌細胞系MCF-7,檢測MDA-MB-231和MCF-7在管道結(jié)構(gòu)形成能力、遷移和侵襲能力的差異,使用westernblot實驗檢測其EMT相關(guān)蛋白表達的差異;運用流式細胞術(shù)分析MDA-MB-231和MCF-7細胞中腫瘤干細胞標記物ALDH1+和CD133+表型細胞的含量,并在MDA-MB-231細胞中分選出帶有ALDH1+及ALDH1-表型的細胞。下文分別將ALDH1+表型的MDA-MB-231細胞和ALDH1-表型的MDA-MB-231簡稱為ALDH1+231和ALDH1-231。2)將分選出的ALDH1+231和ALDH1-231細胞進行低吸附無血清成球培養(yǎng),觀察ALDH1+231和ALDH1-231細胞體外成球能力的差異。3)利用遷移和侵襲實驗觀察ALDH1+231及ALDH1-231細胞的遷移和侵襲能力的差異。4)利用三維培養(yǎng)分析ALDH1+231及ALDH1-231細胞管道結(jié)構(gòu)形成能力的差異。5)利用Western blot檢測ALDH1+231及ALDH1-231細胞中ALDH1的表達和EMT相關(guān)蛋白Twist1,E-cadherin,VM相關(guān)蛋白VE-cadherin的表達差異。三、TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌中腫瘤干細胞對EMT發(fā)生、VM形成及生物學(xué)行為的影響1)選取天津醫(yī)科大學(xué)動物房培育的自發(fā)三陰乳腺癌TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織,將腫瘤組織研磨成單細胞懸液,使用流式細胞術(shù)分析腫瘤組織中具有腫瘤干細胞特異性分子標記物ALDH+和CD133+的腫瘤干細胞含量。2)在本部分實驗中,使用ALDH1作為腫瘤干細胞標記物分選后的乳腺癌細胞記為ALDH1+細胞和ALDH1-細胞,使用CD133作為腫瘤干細胞標記物分選后的乳腺癌細胞記為CD133+細胞和CD133-細胞。分別將分選后的ALDH1+及ALDH1-、CD133+及CD133-共4組腫瘤細胞按照不同細胞量接種于TA2小鼠,觀察腫瘤干細胞對TA2小鼠乳腺癌生物學(xué)行為的影響。3)將TA2小鼠腫瘤組織制成組織切片,進行ALDH1、CD133、VE-cadherin、E-cadherin、Twsit1和endomucin/PAS雙重染色,觀察腫瘤干細胞對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Twsit1、VM形成相關(guān)蛋白VE-cadherin的影響以及對VM形成的作用。研究結(jié)果一、在三陰乳腺癌中CD44表達高于非三陰乳腺癌,CD44陽性患者預(yù)后較差,CD44表達與VE-cadherin表達以及VM呈正相關(guān),CD24表達與VM呈負相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示:在100例乳腺癌病例中,包括CD44陽性病例56例(56%),CD44陰性病例44例(44%),在三陰乳腺癌組織中CD44表達高于非三陰乳腺癌患者(c2=5.884,P=0.016),VM陽性患者中CD44表達明顯升高(c2=3.89,P=0.049)。通過對TNM分期比較,在Ⅲ、Ⅳ期病人的癌組織中CD44表達比Ⅰ,Ⅱ期病人要高(c2=3.89,P=0.049),VEcaderin免疫組化結(jié)果顯示,CD44陽性表達的病例中,VE-cadherin要高于CD44陰性表達病例(c2=4.127,P=0.042)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,CD44陽性患者組比CD44陰性患者組的生存時間短(c2=4.307,P=0.038)。CD44的表達在患者年齡、分級、腫瘤大小、以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異中沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CD24陽性病例占66例(66%),陰性病例占34例(34%),對比CD24陽性和CD24陰性病例發(fā)現(xiàn),VM與CD24表達呈現(xiàn)負相關(guān)(c2=4.397,P=0.036),其他相關(guān)數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學(xué)意義。二、三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231乳腺癌干細胞含量高于非三陰乳腺癌細胞系MCF-7中的含量。ALDH1+231細胞在體外成球能力、侵襲和遷移能力、形成管道的能力均高于ALDH1-231的細胞,并且細胞中EMT相關(guān)蛋白表達較高。1)三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的體外形成管道、遷移、侵襲能力以及EMT相關(guān)蛋白的表達高于非三陰乳腺癌細胞MCF-7。2)流式細胞術(shù)分選結(jié)果證實,在MDA-MB-231中ALDH1+表型細胞的表達占26.87%,CD133+表型細胞占8.75%。MCF-7細胞系中ALDH1+表型細胞占3.4%,CD133+表型細胞占1.27%。3)遷移和侵襲實驗中發(fā)現(xiàn),與ALDH1-231細胞相比,ALDH1+231的細胞侵襲和遷移能力明顯增強。4)三維培養(yǎng)結(jié)果顯示,ALDH1+231細胞的管狀結(jié)構(gòu)形成能力明顯強于ALDH1-231細胞。5)Westernblot結(jié)果顯示,ALDH1+231細胞的VE-cadherin蛋白,Twist1蛋白表達高于ALDH1-231組,E-cadherin蛋白表達低于ALDH1-231組。三、TA2高轉(zhuǎn)移三陰乳腺癌組織中存在腫瘤干細胞,ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細胞具有較強的腫瘤生長能力,并影響EMT相關(guān)蛋白的表達并促進VM的形成。1)在TA2高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中ALDH1+細胞占31.2%,CD133+細胞占6.5%。2)ALDH1+組小鼠的腫瘤生長速度明顯高于ALDH1-組小鼠。CD133+組小鼠腫瘤生長速度明顯高于CD133-組小鼠。3)免疫組化染色后發(fā)現(xiàn),相對于ALDH-組小鼠,ALDH1+組小鼠ALDH1表達升高,同時VE-cadherin,Twist1表達也升高,而E-cadherin表達降低。CD133+組小鼠對比CD133-組,CD133表達升高,同時VE-cadherin和Twist1表達升高,E-cadherin表達降低。4)endomucin/PAS雙重染色結(jié)果顯示,ALDH1+組小鼠中VM陽性率明顯高于ALDH1-組。研究結(jié)論1、人三陰乳腺癌中CD44的表達高于非三陰乳腺癌,CD44陽性患者預(yù)后更差,CD44的表達與乳腺癌中VM、VE-cadherin表達和TNM分期呈正相關(guān),CD24的表達同VM呈負相關(guān)。說明三陰乳腺癌其惡性程度高、患者預(yù)后差可能與乳腺癌干細胞的高含量有關(guān),乳腺癌干細胞可能參與了腫瘤VM的形成。2、三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細胞含量要高于非三陰乳腺癌細胞系MCF-7中的含量。相對于ALDH1-231細胞,ALDH1+231的遷移、侵襲和形成管道結(jié)構(gòu)的能力更強,EMT相關(guān)蛋白表達升高,說明ALDH1+表型的乳腺癌干細胞有更強的VM形成能力,并且促進EMT相關(guān)蛋白的表達。3、在TA2高轉(zhuǎn)移乳腺癌中ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細胞在TA2小鼠中成瘤能力更強,并影響EMT相關(guān)蛋白的表達,進而促進三陰乳腺癌中VM的形成。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
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本文編號：1164075