發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 03:23

  本文關(guān)鍵詞：受體介導(dǎo)的HCV入侵小鼠肝癌細(xì)胞研究

  更多相關(guān)文章： 丙型肝炎病毒 慢病毒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞模型 LDLR SR-BI CD81

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一種經(jīng)血液傳播的RNA病毒,呈全球性流行。全世界有近1.7億人感染,每年的新發(fā)病例約有350萬(wàn)例,感染率約3%。HCV感染機(jī)體后會(huì)引起急性肝炎,其中約75%以上會(huì)轉(zhuǎn)化為慢性肝炎,并逐步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。由于治療方法有限且缺乏合適的疫苗,使得丙型肝炎防治一直是世界性難題,也引起了眾多研究學(xué)者的關(guān)注。HCV具有嚴(yán)格的種屬特異性,只能感染人類(lèi)和黑猩猩。在實(shí)驗(yàn)研究中,由于價(jià)格昂貴及倫理等問(wèn)題難以獲得黑猩猩,導(dǎo)致目前還缺乏有效的可用于HCV感染性研究的細(xì)胞及動(dòng)物模型,這也極大阻礙了HCV感染性研究的進(jìn)程。HCV感染靶細(xì)胞是一個(gè)由多分子共同作用的復(fù)雜過(guò)程。大部分研究者認(rèn)為,介導(dǎo)HCV進(jìn)入靶細(xì)胞的主要受體分子包括低密度脂蛋白受體(Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR)、CD81、B族I型清道夫受體(Scavenger Receptor Class B Type I,SR-BI)、緊密連接區(qū)域Claudin-1(CLDN-1)和occludin(OCLN),且CD81和OCLN是HCV進(jìn)入靶細(xì)胞必不可少的兩個(gè)分子。HCV與低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)或者極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)結(jié)合形成復(fù)合物(lipoviral particles,LVPs),肝細(xì)胞膜表面的葡聚糖氨基聚糖類(lèi)(glycosaminoglycans,GAGs)和低密度脂蛋白受體LDLR可以使LVPs結(jié)合到靶細(xì)胞表面,通過(guò)膜表面其它的HCV受體分子共同作用,最終經(jīng)網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的胞吞作用及低p H引發(fā)病毒包膜與內(nèi)體膜的融合,使得HCV衣殼釋放,進(jìn)入胞漿。盡管CD81和OCLN兩個(gè)分子就可引起病毒進(jìn)入,但其它受體分子在HCV進(jìn)入肝細(xì)胞時(shí)的權(quán)重或聯(lián)合作用能否進(jìn)一步促進(jìn)病毒進(jìn)入還不甚清楚;介導(dǎo)HCV入胞的相關(guān)受體分子是如何參與病毒早期感染的也需要進(jìn)一步探討。本課題的目的是構(gòu)建能夠體外感染HCV的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞模型,并在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究介導(dǎo)HCV入胞的受體分子在病毒對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)源化過(guò)程中的作用。研究結(jié)果如下:一、轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株的篩選。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)HCV多種受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將串聯(lián)表達(dá)介導(dǎo)HCV感染相關(guān)受體分子的重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞,包裝相應(yīng)慢病毒;將包裝的慢病毒攻擊小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6,熒光活細(xì)胞法或加壓篩選得到過(guò)表達(dá)HCV多種膜受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株。RT-PCR、激光共聚焦顯微鏡和免疫印跡均檢測(cè)到相應(yīng)受體分子的表達(dá)。二、構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株可使HCVpp內(nèi)源化。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法,將構(gòu)建的表達(dá)HCV包膜蛋白和螢火蟲(chóng)熒光素酶的兩個(gè)重組載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞,包裝病毒HCVpp;用HCVpp病毒孵育轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,可檢測(cè)到內(nèi)源化的HCVpp。三、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6能使HCV病毒自然感染,且介導(dǎo)HCV入胞的受體分子按照LDLR-SR-BI-CD81和CLDN-1-OCLN的排列順序更易促進(jìn)病毒入侵靶細(xì)胞。通過(guò)HCV陽(yáng)性血清直接感染實(shí)驗(yàn),證實(shí)篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株可被HCV病毒自然感染,且LDLR能促進(jìn)血清病毒進(jìn)入;利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法篩選出LDLR-CD81-SR-BI和CLDN-1-OCLN串聯(lián)順序表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株LCSCO/Hepa1-6;通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6對(duì)血清中HCV病毒的易感性,發(fā)現(xiàn)HCV更易進(jìn)入LSCCO/Hepa1-6細(xì)胞內(nèi),這可能與該細(xì)胞膜表面的HCV受體分子排列順序有關(guān),即HCV受體分子的排列順序?qū)Σ《救肭钟杏绊憽Ｋ�、由于HCV存在形式的不同,導(dǎo)致HCVcc感染與病毒自然感染不同,LDLR在HCVcc病毒內(nèi)源化中所起作用不顯著。通過(guò)比較兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6對(duì)HCVcc的結(jié)合及進(jìn)入,未發(fā)現(xiàn)LDLR的存在對(duì)HCVcc進(jìn)入有明顯的影響;為排除分子串聯(lián)對(duì)其可能存在的影響,使之更接近體內(nèi)狀態(tài),故將串聯(lián)的重組慢病毒載體進(jìn)行改構(gòu)并構(gòu)建單分子表達(dá)的慢病毒載體;經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Hepa1-6后孵育HCVcc,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCV RNA拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn),各受體分子單獨(dú)表達(dá)與串聯(lián)表達(dá)時(shí),病毒內(nèi)源化基本一致;考慮到病毒自然感染與HCVcc感染時(shí)病毒存在形式不同,以及不同病毒入胞與其結(jié)合的受體分子也不同,故將LDLR和SR-BI對(duì)HCVcc進(jìn)入靶細(xì)胞過(guò)程的作用做了比較;發(fā)現(xiàn),SR-BI是HCVcc感染的必需分子。研究結(jié)果表明,HCVcc感染和自然感染不同,靶細(xì)胞膜表面介導(dǎo)HCV入胞的受體分子LDLR對(duì)HCVcc感染影響不明顯。綜上所述,本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)不同數(shù)量和不同串聯(lián)順序的HCV相關(guān)受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6、LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6;證實(shí)了這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株可引起病毒內(nèi)源化,并有望作為細(xì)胞模型用于體外HCV感染的相關(guān)研究;通過(guò)比較細(xì)胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6對(duì)HCV陽(yáng)性血清的易感性,證實(shí)了HCV在進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)要優(yōu)先與SR-BI作用;通過(guò)比較細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6對(duì)HCVcc的易感性,證實(shí)SR-BI是介導(dǎo)HCVcc早期入胞的關(guān)鍵分子,且HCVcc感染與病毒自然感染的早期入胞過(guò)程不同,LDLR在HCVcc早期入胞中作用不明顯。本文通過(guò)對(duì)HCV相關(guān)受體分子在HCV病毒感染細(xì)胞中的作用研究,證實(shí)了HCV在進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)優(yōu)先與SR-BI作用,這為今后抗HCV感染藥物靶點(diǎn)的研究提供了新思路。本研究中構(gòu)建的細(xì)胞模型也為抗HCV感染藥物的篩選、評(píng)價(jià)及疫苗的研制等奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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4 武s，

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