發(fā)布時(shí)間：2017-11-07 10:16

  本文關(guān)鍵詞：BAG-1基因與乳腺癌細(xì)胞TAM敏感性及相關(guān)信號(hào)通路的研究

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【摘要】：目的:在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中,研究BAG-1對(duì)4-羥基-他莫昔芬治療敏感性的影響,并探討B(tài)AG-1基因和AKT,p-AKT,m-TOR,p-mTOR的關(guān)系;研究BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)mTOR抑制劑的治療反應(yīng)性;并探索了mTOR抑制劑聯(lián)合4-羥基-他莫昔芬對(duì)BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌治療效果,為乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥人群的篩選及療效的預(yù)測(cè)提供新的分子指標(biāo)。方法:1.培養(yǎng)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株T47D,首先采用Western Blot驗(yàn)證T47D細(xì)胞株的分子表型;構(gòu)建質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)改變ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株T47D的BAG-1表達(dá)水平,并通過(guò)Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率(T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-)2.確定4-羥基-他莫昔芬的半數(shù)致死量(IC50)所對(duì)應(yīng)的濃度;使用IC50的4-羥基-他莫昔芬(10uM)分別處理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通過(guò)AnnexinV-APC-7AAD雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期以觀察BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)4-羥基-他莫昔芬的敏感性差異。3.使用Western Blot方法檢測(cè)BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中AKT/mTOR的表達(dá)水平,觀察其與BAG-1的關(guān)系。4.確定mTOR抑制劑雷帕霉素的IC50;使用IC50的mTOR抑制劑雷帕霉素(10uM)分別處理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通過(guò)AnnexinV-APC-7AAD雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期以觀察BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性差異。5.使用IC50的mTOR抑制劑雷帕霉素(10uM)聯(lián)合4-羥基-他莫昔芬(10uM)分別處理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,48h后通過(guò)AnnexinV-APC-7AAD雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期以觀察BAG-1不同表達(dá)水平的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療聯(lián)合mTOR抑制劑的敏感性差異。結(jié)果:1.乳腺癌細(xì)胞株T47D與MDA-MB-231及SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞株相比ER高表達(dá),HER-2不表達(dá)。Real-time PCR和Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染了BAG-1 p50質(zhì)粒的T47D細(xì)胞BAG-1 p50的表達(dá)水平較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組升高(P0.05),轉(zhuǎn)染了shRNA的T47D細(xì)胞BAG-1的表達(dá)水平降低(P0.05)。2.使用IC50的4-羥基-他莫昔芬(10uM)分別處理48h后,T47DBAG-1hi與T47Dcon相比對(duì)4-羥基-他莫昔芬的敏感性升高((65.10±2.35)%vs.(55.03±2.39)%,P=0.039),處于G0/G1期細(xì)胞比例上升((66.72±2.63)%vs.(62.15±2.46)%,P=0.093),同時(shí),T47DBAG-1-對(duì)4-羥基-他莫昔芬的敏感性降低((41.70±1.93)%vs.(55.03±2.39)%,P=0.012),處于G0/G1期細(xì)胞比例下降((51.27±2.67)%vs.(62.15±2.46)%,P=0.007)。3.Western Blot檢測(cè)到T47DBAG-1hi和T47DBAG-1-中AKT表達(dá)水平與T47Dcon相比無(wú)明顯變化,但在T47DBAG-1hi中p-AKT、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平與T47Dcon相比明顯降低,T47DBAG-1-中p-AKT、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平與T47Dcon相比升高。4.使用IC50的mTOR抑制劑雷帕霉素(10uM)分別處理48h后,T47DBAG-1hi與T47Dcon相比,細(xì)胞凋亡率降低((50.70±0.59)%vs.(57.07±2.46)%,P=0.065),處于G0/G1期的細(xì)胞百分比下降((53.15±1.63)%vs.(58.23±1.32)%,P=0.014);T47DBAG-1-與T47Dcon相比,細(xì)胞凋亡率增高((66.87±2.27)%vs.(57.07±2.46)%,P=0.043);處于G0/G1期的細(xì)胞百分比上升((65.99±1.49)%vs.(58.23±1.32)%,P=0.002)。5.4-羥基-他莫昔芬聯(lián)合mTOR抑制劑雷帕霉素同時(shí)處理T47DBAG-1hi、T47Dcon和T47DBAG-1-,T47DBAG-1hi與T47Dcon相比,細(xì)胞凋亡率增高((66.93±1.27)%vs.(58.8±1.89)%,P=0.024),處于G0/G1期的細(xì)胞百分比上升((67.28±3.70)%vs.(63.02±3.80)%,P=0.347);T47DBAG-1-與T47Dcon相比,細(xì)胞凋亡率增高((71.23±2.23)%vs.(58.8±1.89)%,P=0.013),處于G0/G1期的細(xì)胞百分比上升((70.53±2.30)%vs.(63.02±3.80)%,P=0.043);發(fā)現(xiàn)三者的細(xì)胞凋亡率及處于G0/G1期的細(xì)胞比例均有所增加,且以T47Dcon為基準(zhǔn),T47DBAG-1-的細(xì)胞凋亡率上升較T47DBAG-1hi明顯((12.43±0.82)%vs.(8.13±0.83)%,P=0.021),處于G0/G1期的細(xì)胞比例增高明顯((4.25±5.70)%vs.(7.51±1.85)%,P=0.044)。結(jié)論:在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞T47D中,BAG-1的表達(dá)水平會(huì)影響4-羥基-他莫昔芬的治療敏感性,BAG-1或許可以成為一項(xiàng)預(yù)測(cè)他莫昔芬治療敏感性的分子指標(biāo),對(duì)于低表達(dá)BAG-1 ER陽(yáng)性易可能出現(xiàn)4-羥基-他莫昔芬耐藥的乳腺癌患者聯(lián)合使用mTOR抑制劑或許更能加強(qiáng)對(duì)疾病的控制,提高治療效果及延長(zhǎng)患者無(wú)病生存期和總生存期。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
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本文編號(hào)：1151982