本文關(guān)鍵詞：幾種DNA生物傳感器用于腫瘤標(biāo)志物的檢測

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【摘要】：惡性腫瘤即癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一,發(fā)病率逐年上升,并且死亡率極高。因此,癌癥的早期診斷與治療是延長患者的存活時間和提高生活質(zhì)量的關(guān)鍵。由于腫瘤成因和發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜性,通過對腫瘤標(biāo)志物的高靈敏檢測有望大大提高腫瘤早期診斷的準(zhǔn)確率。因此,本文研制可以檢測特異性基因(DNA)、miR-21(micro-RNA)、腺苷(小分子)等不同類型腫瘤標(biāo)志物的高靈敏光學(xué)和電化學(xué)檢測系統(tǒng),希望為研究這些標(biāo)志物對判斷腫瘤發(fā)生和發(fā)展的響應(yīng)性以及多元標(biāo)志物之間的相互關(guān)聯(lián)情況提供研究基礎(chǔ)。第一章基于硫黃素T和G-四倍體構(gòu)建一種無酶循環(huán)信號放大技術(shù)的非標(biāo)記型熒光傳感器,用于肝癌相關(guān)基因短片段的檢測。設(shè)計含有特定堿基序列的發(fā)夾DNA探針,該探針與目標(biāo)DNA雜交后產(chǎn)生循環(huán)過程,釋放出信號探針。信號探針折疊形成的G-四倍體結(jié)構(gòu)在一價離子的存在下與硫黃素T(THT)配位,使THT熒光增強。通過記錄加入目標(biāo)DNA前后體系熒光信號的變化,實現(xiàn)對肝癌相關(guān)基因短片段的檢測。在最佳條件下,目標(biāo)DNA濃度在10 fM~350 fM范圍內(nèi),485 nm處的熒光強度與其濃度呈良好的線性關(guān)系,檢測限達2 fM。第二章基于適體探針(Aptamer probes,AP)和發(fā)卡探針(Hairpin probes,HP)在腺苷(Adenosine,AD)存在時的新型結(jié)合模式來構(gòu)建一種非標(biāo)記型電化學(xué)阻抗傳感器。固定在電極表面的AP在腺苷存在時會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu),其發(fā)夾的環(huán)部與HP的環(huán)部部分互補雜交,二者通過環(huán)環(huán)相互作用(類似人類“親吻”行為)形成一個“親吻型適配體復(fù)合物”,由于復(fù)合物的空間位阻作用,使得電極的阻抗信號明顯變大。相反,腺苷不存在時,AP呈舒展?fàn)顟B(tài),無法與HP結(jié)合成穩(wěn)定的“親吻”結(jié)構(gòu),電極的阻抗信號沒有明顯變化,以電子傳遞電阻值作為響應(yīng)信號來檢測腺苷。最佳條件下,腺苷濃度在5 nM~1000 nM范圍內(nèi),電阻值與其濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系,檢測限達0.6 nM。另外,該傳感器具有良好的選擇性,鳥苷、胞苷、尿苷不會影響腺苷的檢測,有望應(yīng)用于臨床實際樣本中腺苷的檢測。第三章基于磁珠(Magnetic beads,MBs)和雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specific nuclease,DSN)輔助目標(biāo)循環(huán),建立一種信號增強型熒光生物傳感器用于microRNA-21(mi R-2)的檢測。當(dāng)mi R-21存在時,捕獲探針(Capture probes,Cps)與其雜交形成DNA/RNA雙螺旋結(jié)構(gòu),DSN能特異性水解雜合雙鏈中的DNA,同時釋放出熒光標(biāo)記片段和完整的miR-21。被釋放出來的miR-21與另一Cp再次雜交并被DSN酶切,如此循環(huán),從而實現(xiàn)恒溫條件下一個mi R-21與多個Cps雜交、酶切,釋放出大量的熒光標(biāo)記片段的循環(huán)過程。最佳條件下,mi R-21濃度在100 fM~5×104 fM范圍內(nèi),熒光強度與其濃度呈良好的線性關(guān)系,檢測限達80 fM。第四章雖然第三章所構(gòu)建的傳感器相比其他基于DSN的方法靈敏度有了很大提高,但是該方法需要標(biāo)記,導(dǎo)致較高的背景信號,靈敏度仍不夠理想,不能用于實際生物樣本的檢測。因此,我們在第三章的基礎(chǔ)上引入Tb3+,利用單鏈DNA可以顯著增強Tb3+的熒光強度,建立一個新型的非標(biāo)記型的熒光生物傳感器,解決了由于標(biāo)記所引起的背景信號高及成本高等缺點,并提高了靈敏度。在最佳實驗條件下,miR-21濃度在50 fM~1 pM范圍內(nèi),熒光強度與其濃度呈良好的線性關(guān)系,檢測限達8 fM。另外,該傳感器具有良好的選擇性,甚至可以識別單堿基錯配的靶miRNA,并成功應(yīng)用于乳腺癌患者細(xì)胞裂解液miR-21的檢測,有望為癌癥早期診斷提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.43

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