本文關(guān)鍵詞：Oct4自噬性降解促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化的分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： Oct4蛋白 CMA自噬 ERK 腫瘤干細(xì)胞分化

【摘要】：研究背景:Oct4是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞以及未分化胚胎癌中,對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新具有極其重要的作用,而且Oct4在重編程和維持干細(xì)胞“干性”中起到重要作用。已有研究報(bào)道稱,在胚胎干細(xì)胞中Oct4可經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解,其中,WWP2(E3泛素蛋白連接酶)可促進(jìn)Oct4泛素化降解。然而,一些報(bào)道稱自噬可以調(diào)控“干性”相關(guān)蛋白(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的穩(wěn)態(tài)變化,進(jìn)而調(diào)控胚胎干細(xì)胞的多能性,其中包括Oct4的自噬性降解過程,但其作用機(jī)制并沒有被闡釋。因此,關(guān)于Oct4蛋白在如何條件下如何被降解仍未定論。自噬(Autophagy)是一種依賴溶酶體的胞內(nèi)物質(zhì)降解過程,目前發(fā)現(xiàn)其降解對(duì)象囊括了從可溶蛋白到完整細(xì)胞器在內(nèi)的所有胞內(nèi)物質(zhì),其中也包括線粒體。自噬可分為小自噬(Microautophagy)、大自噬(Macroautophagy)以及分子伴侶介導(dǎo)自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA),其中CMA途徑可通過Hsp70/Hsc70識(shí)別KFERQ樣序列的蛋白質(zhì)并通過溶酶體途徑選擇性降解底物蛋白,而Oct4是否可被CMA途徑降解未曾報(bào)道。多項(xiàng)研究報(bào)道稱,Oct4蛋白可以被AKT、ERK激酶磷酸化進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的多能性,并能提高細(xì)胞自我更新的能力,證明Oct4蛋白存在表觀遺傳學(xué)修飾,因此,Oct4經(jīng)磷酸化修飾后進(jìn)入自噬降解途徑存在理論依據(jù)。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)利用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分選的鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞樣SP(Side population,SP)樣細(xì)胞中Oct4蛋白的表達(dá)顯著高于n SP(No side population,n SP)樣細(xì)胞,由于SP細(xì)胞群屬于低分化細(xì)胞而n SP細(xì)胞屬于高分化細(xì)胞群,提示Oct4蛋白的質(zhì)量調(diào)控在腫瘤干細(xì)胞分化中起到重要作用。由此,自噬如果可以調(diào)控Oct4蛋白的降解,進(jìn)而也可以影響腫瘤干細(xì)胞的分化。目的:研究Oct4蛋白能否通過CMA發(fā)生自噬性降解,并探究Oct4蛋白翻譯后修飾與CMA選擇性降解的分子機(jī)制,同時(shí)初步探究CMA靶向Oct4蛋白與腫瘤干細(xì)胞分化的調(diào)控關(guān)系。方法:采用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)分選并檢測(cè)了鼻咽癌CEN-2-S18細(xì)胞中SP(Side population,SP)細(xì)胞和n SP(No side population,n SP)細(xì)胞,通過Western blot檢測(cè)了干細(xì)胞“干性”Marker蛋白Oct4的表達(dá)水平;q PCR法檢測(cè)Oct4蛋白的m RNA水平的變化;si RNA干擾技術(shù)敲低LAMP2A、Hsc70和ERK表達(dá)后,檢測(cè)Oct4蛋白的蓄積變化。使用核質(zhì)蛋白分離和提取技術(shù)檢測(cè)Oct4蛋白在細(xì)胞中的分布和量的變化;CHX(Cycloheximide)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Oct4蛋白的穩(wěn)定性;使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Oct4蛋白與Hsc70的相互作用;免疫熒光(Immunofluorescence)觀察Oct4蛋白與溶酶體和Hsc70的共定位;Vector NTI軟件對(duì)Oct4蛋白氨基酸和晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析;定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT-Oct4-SQ和MT-Oct4-AA分別與Hsc70的相互作用。研究結(jié)果:1.Oct4蛋白在CNE-2-S18腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞群中高表達(dá)。在鼻咽癌CNE-2-S18細(xì)胞中,含有高比例的腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞,同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞中的Oct4蛋白量顯著高于n SP細(xì)胞,提示CNE-2-S18中含有大量的鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。2.Oct4蛋白通過阻斷溶酶降解體途徑而顯著蓄積。使用溶酶體阻斷劑(Baf A1、Leu、CQ)、大自噬起始階段阻斷劑(3-MA)和泛素-蛋白酶體阻斷劑(MG132)分別處理CNE-2-S18細(xì)胞12h、6h和12h發(fā)現(xiàn),Oct4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的蓄積依賴于溶酶體降解途徑,而且這種蓄積在其他腫瘤細(xì)胞中也存在,同時(shí)q PCR檢測(cè)Oct4蛋白的m RNA水平并沒有增加。在細(xì)胞中的蓄積并不依賴其m RNA水平的增加。3.Oct4蛋白蓄積依賴于CMA自噬流阻斷由于前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大自噬起始抑制劑3-MA并不能引起Oct4蛋白的顯著蓄積,所以我們推測(cè)Oct4蛋白蓄積很可能是通過另外一條選擇性自噬—CMA。于是,我們敲低CMA自噬關(guān)鍵蛋白LAMP2A和Hsc70發(fā)現(xiàn),確實(shí)顯著提高Oct4蛋白蓄積,而且長(zhǎng)期饑餓誘導(dǎo)條件下再去阻斷CMA自噬流會(huì)使得Oct4顯著蓄積。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象也存在其他腫瘤細(xì)胞中,提示依賴于CMA自噬流阻斷的Oct4蛋白蓄積可能在惡性腫瘤細(xì)胞中是一種普遍現(xiàn)象。4.Oct4蛋白發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)位并與Hsc70相互作用進(jìn)入CMA途徑因?yàn)镺ct4蛋白發(fā)揮生物功能的場(chǎng)所是細(xì)胞核,所以我們猜測(cè)Oct4蛋白要經(jīng)CMA降解必然會(huì)發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)位。通過核質(zhì)蛋白的分離和提取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞核中的Oct4有所降低,而細(xì)胞質(zhì)中的Oct4則出現(xiàn)顯著蓄積。同時(shí),CHX實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)時(shí)間饑餓會(huì)增加Oct4蛋白的不穩(wěn)定性,而這種不穩(wěn)定性很可能是因?yàn)镺ct4蛋白發(fā)生CMA自噬性降解。5.Oct4蛋白中KVFSQ基序是CMA潛在靶向序列通過對(duì)Oct4蛋白生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Oct4蛋白存在潛在的KFERQ樣基序,這段五肽基序KVFSQ在不同物種和POU蛋白家族中存在相對(duì)保守性,尤其FSQ連續(xù)氨基酸序列。Oct4蛋白晶體帶狀模型中,潛在五肽基序KVFSQ位于α螺旋和β折疊之間,這種構(gòu)象更容易發(fā)生空間轉(zhuǎn)動(dòng)來改變其高級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象。同樣,在球狀模型中,Oct4蛋白在執(zhí)行其基本轉(zhuǎn)錄功能時(shí)潛在五肽基序KVFSQ位于空間整體的內(nèi)部。同時(shí),軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),Oct4蛋白中Ser180可以磷酸化模擬KFERQ樣基序。6.ERK介導(dǎo)Oct4蛋白CMA自噬性降解通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建KVFSQ基序的野生型(WT)和KVFAA基序的突變型(MT)Oct4質(zhì)粒,將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入CNE-2-S18細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),突變型Oct4蛋白不能拉出Hsc70蛋白,這一結(jié)果有力證明KVFSQ確實(shí)是Hsc70識(shí)別的基序,即CMA的靶向序列。激酶抑制劑篩選和siRNA干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ERK介導(dǎo)了Oct4蛋白CMA自噬性降解。7.Oct4蛋白經(jīng)CMA途徑降解來調(diào)控腫瘤干細(xì)胞分化通過分析CNE-2-S18中SP細(xì)胞和n SP細(xì)胞的比例,我們發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)的CMA可以促進(jìn)SP細(xì)胞向n SP細(xì)胞轉(zhuǎn)化,而阻斷CMA自噬流后則促進(jìn)n SP細(xì)胞向SP細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,即CMA可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的分化,而因?yàn)榫S持干性的關(guān)鍵蛋白Oct4是通過CMA途徑降解的,所以我們推測(cè)Oct4蛋白是通過CMA對(duì)其量的控制來調(diào)控腫瘤干細(xì)胞分化。結(jié)論:1.Oct4在長(zhǎng)期饑餓條件下可通過CMA(分子伴侶介導(dǎo)自噬)途徑被降解,該過程可對(duì)Oct4進(jìn)行質(zhì)量調(diào)控。2.ERK介導(dǎo)Oct4蛋白CMA降解并通過磷酸化KVFSQ基序,然后被Hsc70所識(shí)別而形成Oct4-Hsc70復(fù)合物被溶酶體膜蛋白LAMP2A識(shí)別并通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入溶酶體降解。3.在腫瘤干細(xì)胞分化過程中,CMA通過對(duì)Oct4的質(zhì)量調(diào)控而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R73-3

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉麗萍;腫瘤誘導(dǎo)細(xì)胞獲得分離[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2003年05期

2 NellBoyce ,陶然;腫瘤干細(xì)胞:惡性腫瘤的種子[J];世界科學(xué);2003年12期

3 任樂榮,劉玉琴;腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];四川腫瘤防治;2004年01期

4 劉坤;腫瘤干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2004年02期

5 邵世宏,姚運(yùn)紅;干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2005年03期

6 劉雨瀟,楊繼建,張惠茹,竇忠英;干細(xì)胞與腫瘤研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2005年06期

7 鐘明媚,陳飛虎;腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)藥;2005年08期

8 鐘明媚,陳飛虎,樊嘉祿;腫瘤干細(xì)胞與腫瘤治療[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué);2005年08期

9 孫建聰,曾波航;腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年03期

10 周思朗;張積仁;;腫瘤干細(xì)胞[J];腫瘤防治研究;2005年11期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡以平;;關(guān)于腫瘤干細(xì)胞問題的一些思考[A];中國(guó)環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)第14屆學(xué)術(shù)交流會(huì)議論文集[C];2009年

2 甄紅英;王淑玲;;力達(dá)霉素抑制腫瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

3 金潤(rùn)銘;;腫瘤干細(xì)胞及其生物學(xué)特點(diǎn)[A];基因開啟未來：新時(shí)代的遺傳學(xué)與科技進(jìn)步——湖北省遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

4 羅丁三;;基于中醫(yī)藥視角下的腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展[A];甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)2013年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

5 陸士新;;腫瘤干細(xì)胞及其對(duì)腫瘤治療理念的影響[A];第三屆中國(guó)腫瘤內(nèi)科大會(huì)教育集暨論文集[C];2009年

6 湯永民;;腫瘤干細(xì)胞及其靶向治療[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)第七屆全國(guó)小兒腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

7 張宏權(quán);;腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[A];第九屆全國(guó)腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)術(shù)大會(huì)暨2011年黑龍江省醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)年會(huì)報(bào)告集[C];2011年

8 吳沛宏;高飛;顧仰葵;;現(xiàn)代腫瘤微創(chuàng)治療進(jìn)展[A];中國(guó)(第七屆)腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)術(shù)大會(huì)暨世界影像導(dǎo)引下腫瘤微創(chuàng)治療學(xué)會(huì)成立籌備大會(huì)論文匯編[C];2011年

9 周凱旋;艾軍;單保恩;;腫瘤干細(xì)胞研究:一個(gè)漫長(zhǎng)且不尋常的旅程[A];第十四屆中國(guó)科協(xié)年會(huì)第17分會(huì)場(chǎng)：環(huán)境危害與健康防護(hù)研討會(huì)論文集[C];2012年

10 譚亞軍;侯啟明;張庶民;;腫瘤干細(xì)胞研究的問題和進(jìn)展[A];2012年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國(guó)藥師周論文集[C];2012年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 潘文;腫瘤干細(xì)胞為癌癥治療帶來新曙光[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

2 本版編輯邋海上飛魚 葛秋芳 王艷紅;揪出腫瘤的“元兇”——腫瘤干細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2007年

3 潘文;腫瘤干細(xì)胞：為根治癌癥帶來新曙光[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

4 記者 葉芳 通訊員 黃金娟;化療可刺激普通腫瘤細(xì)胞變腫瘤干細(xì)胞[N];廣東科技報(bào);2009年

5 記者 藍(lán)建中;滅腫瘤干細(xì)胞有望根治癌癥[N];新華每日電訊;2013年

6 香港麥迪信醫(yī)學(xué)出版有限公司供稿;腫瘤干細(xì)胞將成治癌新靶點(diǎn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

7 記者 楊帆　實(shí)習(xí)生 楊周;“腫瘤干細(xì)胞研究”在渝實(shí)施[N];重慶日?qǐng)?bào);2009年

8 何雷;“973”計(jì)劃腫瘤干細(xì)胞項(xiàng)目啟動(dòng)[N];健康報(bào);2009年

9 記者 陳楓　通訊員 黃金娟 陳捚;廣東院士研究成果將影響癌癥治療策略[N];南方日?qǐng)?bào);2009年

10 高凡;化療或是癌癥復(fù)發(fā)根源[N];科學(xué)導(dǎo)報(bào);2009年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊孟選;荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹突細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂類分子治療小鼠結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 林鋮;人miR-489靶向p38α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[D];浙江大學(xué);2015年

3 孫翠翠;雙聯(lián)芐類化合物Riccardin D的抗腫瘤作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

4 孫蓉;納米載體同步輸送藥物用于腫瘤干細(xì)胞治療的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

5 趙志舉;miR-221對(duì)正常乳腺和乳腺腫瘤干細(xì)胞調(diào)控的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

6 蔡啟亮;CD44+腫瘤干/祖細(xì)胞在前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

7 劉紅;宮頸癌干細(xì)胞的分選及放療抵抗機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

8 侯春英;MET-PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)miRNA-31調(diào)控肺腺癌腫瘤干細(xì)胞功能[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

9 李文新;靶向腫瘤干細(xì)胞“Akt-Oct4”調(diào)控通路的小分子藥物初步研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 葛春蕾;miR-942活化Wnt/β-catenin通路促進(jìn)ESCC腫瘤干細(xì)胞干性的作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邱暢;CD44聯(lián)合Prpc作為胃癌干細(xì)胞的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

2 何文婷;載索拉非尼及蘿卜硫素介孔二氧化硅脂質(zhì)納米粒聯(lián)用體外抗腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞作用研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

3 毛驍麗;穿膜肽聯(lián)合鹽霉素磷脂膠束靶向腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 王喜隆;~1H-MVS參數(shù)Cho/Cr與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物關(guān)系研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 譚燦亮;人甲狀腺癌中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 洪少馥;超聲輻照聯(lián)合紫杉醇對(duì)三維腫瘤球細(xì)胞毒性效果評(píng)價(jià)及其機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

7 張成龍;利用CD133~+腫瘤表面標(biāo)記物分離、鑒定和培養(yǎng)胃癌腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

8 尹曉龍;卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

9 劉觀成;鼻咽癌中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

10 徐望;5-氟尿嘧啶對(duì)人舌鱗癌Tca8113中腫瘤干細(xì)胞富集作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1147661