本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究

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【摘要】：背景腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。作為動(dòng)物模型,非人靈長類動(dòng)物與人類的親緣關(guān)系最近,在遺傳學(xué)和生理學(xué)上與人類最相似。建立腫瘤的非人靈長類動(dòng)物模型可以更利于腫瘤發(fā)病機(jī)理及治療方案的研究。P53基因和P21基因是十分重要的抑癌基因,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、有助于DNA修復(fù)。下調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。目的為了實(shí)現(xiàn)非人靈長類動(dòng)物腫瘤模型,人們期望對動(dòng)物的腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控,降低動(dòng)物P53和P21基因的表達(dá)以促進(jìn)動(dòng)物腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本文旨在應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對恒河猴P53和P21基因進(jìn)行沉默調(diào)控,以期將之應(yīng)用于恒河猴腫瘤模型的建立。方法 (1)慢病毒介導(dǎo)的恒河猴P53和P21基因沉默載體的構(gòu)建及在細(xì)胞水平的驗(yàn)證：測定載體細(xì)胞COS-7中P53和P21基因的表達(dá)水平,對恒河猴P53和P21基因做生物信息學(xué)分析,優(yōu)選靶序列設(shè)計(jì)shRNA,利用慢病毒質(zhì)粒FUGW-TDT構(gòu)建shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,以Real-time PCR檢測P53和P21mRNA表達(dá)水平,以Western blot檢測P53和P21蛋白水平表達(dá)變化。(2)恒河猴P53和P21基因沉默載體包裝及在胚胎水平的驗(yàn)證：挑選3個(gè)COS-7水平沉默效率較高的慢病毒載體進(jìn)行包裝濃縮純化,測定病毒滴度。對恒河猴進(jìn)行超數(shù)排卵2次。每次挑選10個(gè)MⅡ期卵細(xì)胞進(jìn)行單精子卵胞質(zhì)注射,其中8個(gè)進(jìn)行卵周隙慢病毒注射,每個(gè)慢病毒注射4個(gè)受精卵,另外兩個(gè)未做病毒感染,即空白對照。體外培養(yǎng)120 h,待胚胎發(fā)育至桑葚胚時(shí)觀察熒光。結(jié)果(1)慢病毒介導(dǎo)的恒河猴P53和P21基因沉默載體構(gòu)建成功并在細(xì)胞水平驗(yàn)證有效：COS-7細(xì)胞P53和P21基因表達(dá)水平較高,可以用于基因沉默效率檢測；篩選到P53的3個(gè)靶位點(diǎn),分別位于P53 mRNA的238-258 bp,681-701 bp,169-189 bp,均在開放閱讀框內(nèi)。mRNA水平沉默效率為(87.17±4.03)%,(72.62±4.11)%,(76.22±0.98)%,蛋白水平沉默效率為(84.44+2.18)%,(71.04±1.18)%,(74.17±0.95)%；篩選到P21的四個(gè)靶位點(diǎn),分別位于P21 mRNA的541-561bp、542-562bp、 215-239bp、624-648bp,均在開放閱讀框內(nèi)。mRNA水平沉默效率為(91.82±3.21)%、(82.47±2.48)%、(81.31±2.69)%和(87.354±4.59)%,蛋白水平沉默效率為(88.03±0.53)%、(79.78±0.42)%、(76.79±0.63)%和(85.58±0.61)%。(2)恒河猴P53和P21基因沉默載體包裝滴度達(dá)到要求并在注射胚胎后可見紅色熒光：本實(shí)驗(yàn)包裝病毒后得到滴度分別為2.51 × 109 IU/ml,1.76×109 IU/ml和1.06×l09IU/ml,均大于1×109 IU/ml,滿足胚胎感染的要求。在卵周隙注射慢病毒120h后,待胚胎發(fā)育到桑葚胚時(shí)均可見紅色熒光,而未注射病毒的對照組無熒光。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)篩選得到有效的恒河猴P53和P21shRNA慢病毒表達(dá)載體,完成了細(xì)胞水平的基因沉默效率驗(yàn)證。包裝的高滴度慢病毒注射恒河猴胚胎后在桑葚胚期可見紅色熒光,實(shí)現(xiàn)了胚胎水平的初步驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-3

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本文編號(hào)：1146053