本文關(guān)鍵詞：miR-200c對三陰性乳腺癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

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【摘要】：研究背景乳腺癌是女性最常見的惡性、高度異質(zhì)性腫瘤之一。根據(jù)2011年St.Gallen國際會議共識,乳腺癌被分為腔管A型、腔管B型、HER2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌(Basal-like breast cancer,BLBC)。BLBC因ER陰性、Pg R陰性、HER2陰性,屬于三陰性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)范疇,在臨床不能應(yīng)用內(nèi)分泌治療,且抗HER2治療無效,主要治療手段是化療,因此尋找有效針對三陰性乳腺癌的治療靶點(diǎn),對乳腺癌進(jìn)行個體化治療是目前臨床研究乳腺癌的重要方向。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是使具有極性的上皮細(xì)胞經(jīng)過多個生物化學(xué)改變,獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程。從啟動至完成EMT涉及多個分子生物過程,如轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞骨架蛋白的重組和表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生以及特定mi RNA的表達(dá)等。上述分子生物學(xué)的改變將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的特征發(fā)生一系列變化,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性,與上皮細(xì)胞相互作用的基底膜降解,間質(zhì)樣細(xì)胞形成并從其起源的上皮層遷移。正常情況下,EMT是機(jī)體胚胎發(fā)育以及機(jī)體修復(fù)受傷組織的重要調(diào)控機(jī)制,病理情況下,EMT則是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。Snail-2(Slug)是EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子之一,可通過多種途徑調(diào)節(jié)EMT。E-cadherin是一種細(xì)胞粘附分子,可阻止細(xì)胞移動、侵襲和轉(zhuǎn)移,抑制EMT的發(fā)生,E-cadherin丟失是EMT發(fā)生的最主要特征。已經(jīng)證實,Slug可通過結(jié)合E-cadherin基因啟動子的E盒而直接抑制其表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致EMT的發(fā)生。mi RNA是一類長約22-25nt的非編碼RNA,可與m RNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated regions,3’UTR)結(jié)合,負(fù)向調(diào)控m RNA。mi R-200家族包括mi R-200a、mi R-200b、mi R-200c、mi R-141和mi R-429,均可抑制EMT,降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,屬于腫瘤抑制性mi RNA。mi R-200c可通過靶向結(jié)合ZEB1、ZEB2、HMGB1和Pin1等因子調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT過程,表明mi R-200c在調(diào)節(jié)乳腺癌浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,是目前研究乳腺癌EMT的熱點(diǎn)。Liu、Fu等分別在人前列腺癌細(xì)胞系和惡性膠母質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),mi R-200c可通過靶向下調(diào)Slug進(jìn)而抑制EMT過程。本課題組前期通過基因分析預(yù)測mi R-200c可以與Slug結(jié)合,并以三陰性BT549細(xì)胞為研究對象,通過RT-PCR和Western Blot等技術(shù)檢測Slug和E-cadherin在m RNA及蛋白水平的表達(dá)情況,采用侵襲實驗和劃痕實驗檢測BT549轉(zhuǎn)染mi R-200c后侵襲、遷移能力的變化情況,表明mi R-200c在BT549中可通過抑制Slug的表達(dá)進(jìn)而提升E-cadherin的表達(dá),抑制細(xì)胞遷移。而2015年St Gallen早期乳腺癌國際專家共識指出,三陰性乳腺癌之間仍存在較大異質(zhì)性,部分三陰性乳腺癌對化療敏感,預(yù)后較好;另一部分則對同樣的化療方案高度耐藥。至本研究開題時,僅有本課題組前期對三陰性細(xì)胞系BT549轉(zhuǎn)染mi R-200c用于研究Slug調(diào)控EMT機(jī)制的報道,由于乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病,在其它乳腺癌細(xì)胞系中mi R-200c是否通過上述途徑調(diào)控EMT尚未見報道。目的本研究選用三陰性細(xì)胞系(BT549、MDA-MB-231)和非三陰性細(xì)胞系(腔管A型的MCF-7、HER2過表達(dá)型的SK-BR-3),對兩組細(xì)胞系轉(zhuǎn)染mi R-200c模擬物及其陰性對照物,檢測Slug和E-cadherin在m RNA、蛋白水平的表達(dá)變化情況,觀察mi R-200c對三陰性細(xì)胞系遷移能力的影響情況,探討mi R-200c對三陰性乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)作用,以期為臨床診治三陰性乳腺癌提供新的靶標(biāo)。材料和方法1研究對象和分組選擇三陰性乳腺癌細(xì)胞系BT549和MDA-MB-231,腔管A型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,HER2過表達(dá)型SK-BR-3為研究對象。所有細(xì)胞均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各細(xì)胞系按轉(zhuǎn)染物質(zhì)不同分為:mi R-200c模擬物/Lipo2000組(A組)、mi R-200c陰性對照物/Lipo2000組(B組)、mi RNA陰性對照物/Lipo2000組(C組),終濃度均為50 n M,同時設(shè)置轉(zhuǎn)染等量Lipo2000的組別為試劑對照組(D組),未處理組為空白對照組(E組)。2實驗方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染四個細(xì)胞系均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濕潤環(huán)境。在細(xì)胞處于對數(shù)期時,將細(xì)胞按一定數(shù)量接種于六孔板,常規(guī)培養(yǎng)24h后,對每個細(xì)胞系按分組不同,在六孔板中分別轉(zhuǎn)染不同物質(zhì)后進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞鋪孔底95%以上時,進(jìn)行后續(xù)操作。2.2總RNA提取以及RT-PCR提取各組細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為c DNA。設(shè)計并合成GAPDH、Slug和E-cadherin基因的上、下游引物,檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-200c模擬物及其陰性對照物后Slug和E-cadherin在m RNA水平的表達(dá)情況。2.3總蛋白提取以及Western Blot提取各組細(xì)胞的總蛋白,用以檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-200c模擬物及其陰性對照后Slug和E-cadherin在蛋白水平的表達(dá)情況。2.4劃痕實驗將BT549和MDA-MB-231均勻接種于六孔板中,培養(yǎng)約24 h后,對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理,更換不含抗體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約36-48 h后,用高壓滅菌的200μl槍頭對各組細(xì)胞劃平行直線,用以檢測mi R-200c對三陰性乳腺癌細(xì)胞系遷移能力的影響。3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于計量資料,用x±s表示,各株細(xì)胞系間比較和細(xì)胞系內(nèi)各處理組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。選擇每個細(xì)胞系對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行消化,并接種于六孔板。根據(jù)實驗設(shè)計,對BT549和MDA-MB-231,選用1×105/孔的濃度將細(xì)胞接種于六孔板以進(jìn)行后續(xù)試驗;對MCF-7和SK-BR-3,則選用3×105/孔的濃度2空白對照組Slug、E-cadherin的m RNA和蛋白表達(dá)量三陰性細(xì)胞系與非三陰性細(xì)胞系相比,空白對照組Slug、E-cadherin在m RNA與蛋白水平的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.65和6.57,P0.001和P=0.015;F=92.72和255.64,P0.001)。3 mi R-200c對兩組細(xì)胞系Slug、E-cadherin的影響轉(zhuǎn)染mi R-200c后,三陰性細(xì)胞系Slug在m RNA和蛋白水平表達(dá)量均明顯降低(F=39.29和35.73;41.79和38.31,P0.001),E-cadherin在m RNA和蛋白水平表達(dá)量均明顯增高(F=78.44和81.34;262.2和63.54,P0.001)。4 mi R-200c對三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響轉(zhuǎn)染mi R-200c模擬物組的劃痕寬度恢復(fù)率隨時間的延長愈顯低于其他組,尤其在36 h時細(xì)胞遷移能力明顯下降(F=8.23和12.99,P0.001)。結(jié)果1細(xì)胞選擇結(jié)論mi R-200c僅在TNBC細(xì)胞系中發(fā)揮下調(diào)Slug、提高E-cadherin表達(dá),進(jìn)而抑制EMT的作用。
【關(guān)鍵詞】：三陰性乳腺癌細(xì)胞 miR-200c Slug E-cadherin 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞對照表14-15
• 1 引言15-19
• 2 材料與方法19-36
• 3 結(jié)果36-45
• 4 討論45-50
• 5 結(jié)論50-51
• 6 創(chuàng)新點(diǎn)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述 miRNA與三陰性乳腺癌關(guān)系的研究進(jìn)展56-72
• 1 乳腺癌56-57
• 2 TNBC57-58
• 3 miRNA58
• 4 miRNA與TNBC58-65
• 5 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 個人簡介及攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章72-73
• 致謝73

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