沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘毎δ艿挠绊?/H1>
發(fā)布時間：2017-11-02 01:05
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【摘要】：1.1背景和目的URG11在肝癌、胃癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織證實比正常組織表達高[1-5],同時也在細胞生長增殖、細胞黏附、遷移、淋巴細胞轉(zhuǎn)移、以及信號通路轉(zhuǎn)導都有關(guān)鍵作用[6-9]。有研究通過si RNA技術(shù)干擾胃癌細胞URG11的表達,胃癌細胞的增殖和克隆形成能力受到明顯抑制,而且還可顯著削弱其在體外轉(zhuǎn)移和侵襲能力,以及抑制在動物體內(nèi)的成瘤性和生物學行為[10-14],腫瘤的生物學行為明顯受到抑制。經(jīng)過我們前期研究,證實了URG11在前列腺癌中比正常前列腺組織表達有差異,并且URG11表達強度與其在癌癥的病理等級、分化程度、TNM及是否轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。在前列腺癌細胞細胞系中URG11 m RNA及蛋白表達明顯高于前列腺上皮細胞,且有顯著性差異,在LNCa P系中表達異常最顯著[15]。然而URG11在前列腺癌細胞生物學功能的影響尚未闡述,RNA干擾(RNAi)是一種新興的的基因診治方法,是指利用小RNA序列抑制特定基因信號序列,利用治療序列的si RNA使細胞出現(xiàn)特定基因缺失,以達到某些實驗或治療目的,在腫瘤的基因診治中有光明前途[10-14]。本課題擬擬運用細胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測沉默URG11在前列腺癌細胞(LNCa P細胞系)表達特性及MTS/CCK-8法、流式檢測技術(shù)、細胞遷移實驗(劃痕檢測)及Transwell檢測發(fā)探究沉默URG11基因后對于LNCa P細胞增殖、凋亡及侵襲力的生物學行為的改變影響,本研究采用RNAi方法干擾沉默URG11在前列腺癌細胞的中表達,明確其在PCa中發(fā)生、發(fā)展作用功能,闡明URG11在PCa中發(fā)病變機制,證實URG11基因可以作為PCa的基因治療提供了一個新的潛在靶點,進一步證實URG11在PCa表達特性及基因靶向診治有效性,為治療PCa基因治療提供新的路線和理論基礎。1.2方法1.細胞培養(yǎng),設計URG11si RNA干擾序列片段及反密碼鏈(由sigma公司提供)、通過通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選最合適的URG11si RNA及抑制適合濃度。根據(jù)文獻我們設計URG11si RNA干擾片段(3對),構(gòu)建含URG11si RNA慢病毒質(zhì)粒載體,將慢病毒載體質(zhì)粒與LNCa P細胞混合培養(yǎng),用慢病毒質(zhì)粒感染LNCa P細胞,Real-time-PCR和Western blot鑒定有效的干擾載體及合適濃度。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細胞株。利用篩選出URG11si RNA特異性干擾片段的質(zhì)粒感染LNCa P細胞,用含空載質(zhì)粒體的做對照,通過Real-time-PCR和Western blot測定干擾后URG11基因m RNA在細胞中的表達。3.沉默URG11對PCa細胞生物學行為改變的影響。MTS/CCK-8法檢測沉默后列腺癌細胞增殖;FCM檢測細胞方法檢測沉默后生長周期及凋亡程度;遷移實驗及Transwell小室檢測沉默后侵襲及轉(zhuǎn)移能力等其他生物學行為。1.3結(jié)果1.篩選URG11siRNA特異性干擾片段通過由sigma公司提供干擾序列片段及反密碼鏈SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT轉(zhuǎn)染URG11高表達的前列腺癌LNCa P細胞,利用Real-time-PCR、Western blot及RNA Structure軟件分析得出三條干擾片段各個濃度的URG11 m RNA表達能力顯示:SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)對細胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24;經(jīng)2-△△Ct法計算處理,經(jīng)過與空白組的對比,LNCa P前列腺癌細胞中URG11 m RNA表達抑制率高達78.25%,經(jīng)方差分析F=952.12,P0.000,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,三個干擾片段中SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)具有良好的抑制URG11效果,SASI-Hs01-00182413片段干擾效率最高、最穩(wěn)定及最有效濃度50n M/ul。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細胞株將篩選的有效URG11si RNA干擾片段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LNCa P細胞株,Real-time-PCR和WB檢測沉默后的LNCa P的細胞株,在LNCa P細胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±0.18;經(jīng)2-△△Ct法計算處理,經(jīng)過與空白組的對比,LNCa P前列腺癌細胞中URG11 m RNA表達抑制率高達78.72%,在PC3前列腺癌細胞系抑制率為62.01%。根據(jù)干擾后的抑制效果,篩選的URG11si RNA干擾片段及其濃度復合我們要求,經(jīng)過轉(zhuǎn)染細胞后也能很好抑制前列腺癌細胞,兩個細胞系中URG11 m RNA明顯降低,經(jīng)方差分析F=867.28,P0.000,具有統(tǒng)計學意義。Westernblot檢測實驗組與對照組對比OD值(95.1285/1993.015),通過上述實驗證實了沉默內(nèi)源性LNCa P的前列腺癌細胞株成功建立。3..MTS/CCK-8法檢測沉默后的LNCa P細胞增殖通過MTS/CCK-8法檢檢測沉默后的LNCa P細胞,與對照組比較,從表5中,我們可以判斷出在0h時LNCa P細胞對URG11增殖敏感性,經(jīng)過配對t檢驗,t=0.300;p=0.266,,按α=0.05,沒有統(tǒng)計學意義;經(jīng)過沉默24h/48h/72h后,,表7中經(jīng)過軟件的計算,可以經(jīng)過沉默24h/48h/72h后實驗組的抑制率對比:7.15%;8.75%;10.75%,對照組中-0.60%;-0.49%;-0.21%,經(jīng)過配對t檢驗,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:3.72,p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,通過比較,證實了通過URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細胞增殖受到抑制。4.FCM分析沉默后的LNCa P細胞的細胞周期和凋亡指數(shù)通過流式細胞儀分析沉默后LNCa P細胞的細胞周期和凋亡指數(shù),與對照組比較,經(jīng)過轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細胞培育48/72h后,實驗組停留在G1期的百分比分別為:64.13%;66.98%,在四倍體G2及最終分裂期M期細胞百分比:10.38%、8.14%,對于對照組分析,停留在G1期的百分比分別為:55.94%;53.39%,在四倍體G2及最終分裂期M期細胞百分比:11.28%;9.25%,經(jīng)過配對t檢驗,p0.05,按α=0.05,經(jīng)過轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細胞培育48/72h后,實驗組在分析軟件上UR+LR細胞百分比分別為:8.48%;8.83%,對于對照組分析,UR+LR細胞百分比分別為:1.47%;1.55%,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:6.424;6.357,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,在凋亡早晚期分析中,沉默48h后前列腺癌細胞分別為:2.52%;5.96%,沉默72h后前列腺癌細胞分別為:2.95%;5.88%,經(jīng)過配對t檢驗,p0.05,我們可以認為無統(tǒng)計學意義,通過流式細胞儀分分析數(shù)據(jù)可以證實通過URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細胞生長受到抑制,LNCaP細胞凋亡率增加。5.Transwell小室檢測侵襲實驗和細胞遷移實驗與對照組比較,經(jīng)過URG11si RNA干擾片段沉默后前列腺癌細胞在0h、6h、24h、48h的細胞侵襲轉(zhuǎn)移分別為:423.53±16.16;420.06±8.4;408.47±16.07;391.46±21.05,對照組前列腺癌細胞在0h、6h、24h、48h的細胞遷移分別為:529.41±12.09;518.48±8.62;451.22±48.19;393.07±15.33;轉(zhuǎn)算為遷移率,實驗組分別為:0.00%;0.82%;3.56%;7.57%,對照組遷移率分別為0.00%;2.06%;14.77%;25.5%,,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:3.786;5.234;5.681,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義;經(jīng)過沉默后的.LNCa P細胞遷移數(shù)目明顯比對照組少,經(jīng)過URG11si RNA轉(zhuǎn)染48h后,6組實驗組細胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):75.17±17.12個;6組對照組細胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):164.33±20.03個,經(jīng)過配對t檢驗,t值為:6.73,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義;轉(zhuǎn)染48h后,6組實驗組細胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):142.83±10.91個;6組對照組細胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):234±8.29個,經(jīng)過配對t檢驗,t值為:4.023.p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,經(jīng)過沉默后的前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力明顯降低,也證實了干擾片段的沉默抑制作用。1.4結(jié)論經(jīng)過URG11si RNA干擾后沉默的LNCa P細胞在增殖速度、分裂、侵襲能力下降;加快凋亡;腫瘤生物學行為改變,證實URG11si RNA有效性,URG11可能是促進前列腺癌細胞增殖、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的潛在基因。1.5本研究的創(chuàng)新之處通過前期研究,前列腺癌細胞URG11 m RNA蛋白表達水與良性前列腺組織有顯著性差異,尚未有文章對于URG11在前列腺癌生物行為及沉默URG11后的研究,本研究通過篩選實驗等到URG11si RNA有效有效干擾片段SASI-Hs01-00182413及有效濃度50n M/ul,擬運用細胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測沉默URG11在LNCa P細胞表達特性及MTS/CCK-8法檢測沉默后細胞增殖、FCM檢測細胞凋亡及周期、Transwell細胞遷移、侵襲能力等生物學行為,檢驗沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘毎飳W性改變,明確URG11基因在LNCa P細胞的功能。實驗證實了URG11基因可能時前列腺癌細胞治療潛在的基因。
【關(guān)鍵詞】：URG11 URG11siRNA 前列腺癌 前列腺癌基因治療
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】： - 中文摘要3-8
- ABSTRACT8-13
- 前言13-16
- 1.1 前列腺癌流行病學概況13
- 1.2 前列腺癌的篩查及治療現(xiàn)狀13-15
- 1.3 URG11的國內(nèi)外研究進展15-16
- 第一章 URG11siRNA篩選實驗16-26
- 1.實驗材料16-21
- 1.1 URG11siRNA 干擾序列片段及反密碼鏈由 sigma 設計公司提供16-17
- 1.2 實驗方法17-18
- 1.3 細胞培養(yǎng)18
- 1.4 siRNA 篩選轉(zhuǎn)染18-19
- 1.5 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建19
- 1.6 細胞轉(zhuǎn)染19-20
- 1.7 western blotting20-21
- 2.實驗方法21
- 2.1 總蛋白抽提21
- 2.2 蛋白樣品初步定量21
- 3 SDS-PAGE 電泳21
- 4 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移21-22
- 5 免疫印記22
- 6 總 RNA 純度和完整性檢測22-24
- 7 URG11siRNA篩選實驗結(jié)果24-25
- 8 實驗結(jié)果討論25-26
- 第二章 RNA干擾URG11基因表達對LNCAP細胞增殖和調(diào)亡的研究26-35
- 1.構(gòu)建穩(wěn)定沉默內(nèi)源性URG11的前列腺癌細胞株26-29
- 2.Western Blot 檢驗沉默后 LNCAP 細胞的 URG11 蛋白表達情況29-31
- 3.MTS/CCK-8 法檢測細胞增殖31-32
- 4.Transwell 檢測細胞遷移能力32
- 5.流式檢測細胞凋亡32-33
- 6.流式檢測細胞周期33
- 7.細胞遷移實驗（劃痕檢測）33-34
- 8.transwell 檢測細胞侵襲能力34-35
- 第三章 RNA干擾URG11基因表達對LNCAP細胞增殖和調(diào)亡的研究結(jié)果35-52
- 1 前列腺癌細胞系的培養(yǎng)情況35-36
- 2.Real-time-PCR檢驗沉默后LNCaP細胞的URG11mRNA表達情況36-38
- 3.Western Blot檢驗沉默后LNCaP細胞的URG11蛋白表達情況38-40
- 4.CCK-8 檢驗沉默后LNCaP細胞增殖檢測40-41
- 5.CCK-8 檢驗沉默后 LNCaP 細胞增殖檢測結(jié)果41-42
- 6.FCM 細胞周期檢測42-43
- 7.流式沉默后前列腺癌細胞周期結(jié)果43-44
- 8.流式檢測細胞凋亡率44-45
- 9.FCM 沉默后前列腺癌細胞凋亡結(jié)果45-46
- 10.細胞劃痕實驗46-48
- 11.細胞遷移實驗（劃痕檢測）結(jié)果48
- 12.細胞遷移實驗48-50
- 13.Transwell 檢測沉默后前列腺癌細胞遷移能力結(jié)果50
- 14.細胞侵襲實驗50-52
- 15.Transwell 檢測沉默后前列腺癌細胞侵襲能力結(jié)果52
- 第四章 討論52-57
- 全文總結(jié)57-58
- 1 本課題的選題思路及創(chuàng)新性57
- 2 本研究的結(jié)果及其意義57
- 3 本課題中存在的不足及展望57-58
- 結(jié)論58
- 參考文獻58-65
- 實驗主要試劑及儀器65-70
- 附錄 1. 縮略詞表70-71
- 附錄 271-73
- 致謝73
【參考文獻】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條
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3 蒲永昌;高斌;;經(jīng)直腸前列腺18針穿刺活檢與10針活檢在PSA(4～10μg/L)患者中診斷前列腺癌的對比性研究[J];吉林醫(yī)學;2015年09期
4 李超;;靜脈麻醉和局麻下經(jīng)直腸行前列腺穿刺活檢診斷前列腺癌研究[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2015年06期
5 楊國強;符偉軍;王忠新;王威;朱大慶;費翔;曹曉林;高江平;張旭;;12+X法超聲引導下經(jīng)會陰前列腺穿刺活檢術(shù)35例報告[J];臨床泌尿外科雜志;2014年12期
6 孫翔;鐘柯兆;羅龍華;錢軍;;定向抗菌預防法在防治經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢術(shù)后感染的應用評價[J];中華醫(yī)院感染學雜志;2014年15期
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本文編號：1129286
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【摘要】：1.1背景和目的URG11在肝癌、胃癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織證實比正常組織表達高[1-5],同時也在細胞生長增殖、細胞黏附、遷移、淋巴細胞轉(zhuǎn)移、以及信號通路轉(zhuǎn)導都有關(guān)鍵作用[6-9]。有研究通過si RNA技術(shù)干擾胃癌細胞URG11的表達,胃癌細胞的增殖和克隆形成能力受到明顯抑制,而且還可顯著削弱其在體外轉(zhuǎn)移和侵襲能力,以及抑制在動物體內(nèi)的成瘤性和生物學行為[10-14],腫瘤的生物學行為明顯受到抑制。經(jīng)過我們前期研究,證實了URG11在前列腺癌中比正常前列腺組織表達有差異,并且URG11表達強度與其在癌癥的病理等級、分化程度、TNM及是否轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。在前列腺癌細胞細胞系中URG11 m RNA及蛋白表達明顯高于前列腺上皮細胞,且有顯著性差異,在LNCa P系中表達異常最顯著[15]。然而URG11在前列腺癌細胞生物學功能的影響尚未闡述,RNA干擾(RNAi)是一種新興的的基因診治方法,是指利用小RNA序列抑制特定基因信號序列,利用治療序列的si RNA使細胞出現(xiàn)特定基因缺失,以達到某些實驗或治療目的,在腫瘤的基因診治中有光明前途[10-14]。本課題擬擬運用細胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測沉默URG11在前列腺癌細胞(LNCa P細胞系)表達特性及MTS/CCK-8法、流式檢測技術(shù)、細胞遷移實驗(劃痕檢測)及Transwell檢測發(fā)探究沉默URG11基因后對于LNCa P細胞增殖、凋亡及侵襲力的生物學行為的改變影響,本研究采用RNAi方法干擾沉默URG11在前列腺癌細胞的中表達,明確其在PCa中發(fā)生、發(fā)展作用功能,闡明URG11在PCa中發(fā)病變機制,證實URG11基因可以作為PCa的基因治療提供了一個新的潛在靶點,進一步證實URG11在PCa表達特性及基因靶向診治有效性,為治療PCa基因治療提供新的路線和理論基礎。1.2方法1.細胞培養(yǎng),設計URG11si RNA干擾序列片段及反密碼鏈(由sigma公司提供)、通過通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選最合適的URG11si RNA及抑制適合濃度。根據(jù)文獻我們設計URG11si RNA干擾片段(3對),構(gòu)建含URG11si RNA慢病毒質(zhì)粒載體,將慢病毒載體質(zhì)粒與LNCa P細胞混合培養(yǎng),用慢病毒質(zhì)粒感染LNCa P細胞,Real-time-PCR和Western blot鑒定有效的干擾載體及合適濃度。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細胞株。利用篩選出URG11si RNA特異性干擾片段的質(zhì)粒感染LNCa P細胞,用含空載質(zhì)粒體的做對照,通過Real-time-PCR和Western blot測定干擾后URG11基因m RNA在細胞中的表達。3.沉默URG11對PCa細胞生物學行為改變的影響。MTS/CCK-8法檢測沉默后列腺癌細胞增殖;FCM檢測細胞方法檢測沉默后生長周期及凋亡程度;遷移實驗及Transwell小室檢測沉默后侵襲及轉(zhuǎn)移能力等其他生物學行為。1.3結(jié)果1.篩選URG11siRNA特異性干擾片段通過由sigma公司提供干擾序列片段及反密碼鏈SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT轉(zhuǎn)染URG11高表達的前列腺癌LNCa P細胞,利用Real-time-PCR、Western blot及RNA Structure軟件分析得出三條干擾片段各個濃度的URG11 m RNA表達能力顯示:SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)對細胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24;經(jīng)2-△△Ct法計算處理,經(jīng)過與空白組的對比,LNCa P前列腺癌細胞中URG11 m RNA表達抑制率高達78.25%,經(jīng)方差分析F=952.12,P0.000,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,三個干擾片段中SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)具有良好的抑制URG11效果,SASI-Hs01-00182413片段干擾效率最高、最穩(wěn)定及最有效濃度50n M/ul。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細胞株將篩選的有效URG11si RNA干擾片段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LNCa P細胞株,Real-time-PCR和WB檢測沉默后的LNCa P的細胞株,在LNCa P細胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±0.18;經(jīng)2-△△Ct法計算處理,經(jīng)過與空白組的對比,LNCa P前列腺癌細胞中URG11 m RNA表達抑制率高達78.72%,在PC3前列腺癌細胞系抑制率為62.01%。根據(jù)干擾后的抑制效果,篩選的URG11si RNA干擾片段及其濃度復合我們要求,經(jīng)過轉(zhuǎn)染細胞后也能很好抑制前列腺癌細胞,兩個細胞系中URG11 m RNA明顯降低,經(jīng)方差分析F=867.28,P0.000,具有統(tǒng)計學意義。Westernblot檢測實驗組與對照組對比OD值(95.1285/1993.015),通過上述實驗證實了沉默內(nèi)源性LNCa P的前列腺癌細胞株成功建立。3..MTS/CCK-8法檢測沉默后的LNCa P細胞增殖通過MTS/CCK-8法檢檢測沉默后的LNCa P細胞,與對照組比較,從表5中,我們可以判斷出在0h時LNCa P細胞對URG11增殖敏感性,經(jīng)過配對t檢驗,t=0.300;p=0.266,,按α=0.05,沒有統(tǒng)計學意義;經(jīng)過沉默24h/48h/72h后,,表7中經(jīng)過軟件的計算,可以經(jīng)過沉默24h/48h/72h后實驗組的抑制率對比:7.15%;8.75%;10.75%,對照組中-0.60%;-0.49%;-0.21%,經(jīng)過配對t檢驗,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:3.72,p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,通過比較,證實了通過URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細胞增殖受到抑制。4.FCM分析沉默后的LNCa P細胞的細胞周期和凋亡指數(shù)通過流式細胞儀分析沉默后LNCa P細胞的細胞周期和凋亡指數(shù),與對照組比較,經(jīng)過轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細胞培育48/72h后,實驗組停留在G1期的百分比分別為:64.13%;66.98%,在四倍體G2及最終分裂期M期細胞百分比:10.38%、8.14%,對于對照組分析,停留在G1期的百分比分別為:55.94%;53.39%,在四倍體G2及最終分裂期M期細胞百分比:11.28%;9.25%,經(jīng)過配對t檢驗,p0.05,按α=0.05,經(jīng)過轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細胞培育48/72h后,實驗組在分析軟件上UR+LR細胞百分比分別為:8.48%;8.83%,對于對照組分析,UR+LR細胞百分比分別為:1.47%;1.55%,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:6.424;6.357,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,在凋亡早晚期分析中,沉默48h后前列腺癌細胞分別為:2.52%;5.96%,沉默72h后前列腺癌細胞分別為:2.95%;5.88%,經(jīng)過配對t檢驗,p0.05,我們可以認為無統(tǒng)計學意義,通過流式細胞儀分分析數(shù)據(jù)可以證實通過URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細胞生長受到抑制,LNCaP細胞凋亡率增加。5.Transwell小室檢測侵襲實驗和細胞遷移實驗與對照組比較,經(jīng)過URG11si RNA干擾片段沉默后前列腺癌細胞在0h、6h、24h、48h的細胞侵襲轉(zhuǎn)移分別為:423.53±16.16;420.06±8.4;408.47±16.07;391.46±21.05,對照組前列腺癌細胞在0h、6h、24h、48h的細胞遷移分別為:529.41±12.09;518.48±8.62;451.22±48.19;393.07±15.33;轉(zhuǎn)算為遷移率,實驗組分別為:0.00%;0.82%;3.56%;7.57%,對照組遷移率分別為0.00%;2.06%;14.77%;25.5%,,經(jīng)過配對t檢驗,t值分別為:3.786;5.234;5.681,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義;經(jīng)過沉默后的.LNCa P細胞遷移數(shù)目明顯比對照組少,經(jīng)過URG11si RNA轉(zhuǎn)染48h后,6組實驗組細胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):75.17±17.12個;6組對照組細胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):164.33±20.03個,經(jīng)過配對t檢驗,t值為:6.73,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義;轉(zhuǎn)染48h后,6組實驗組細胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):142.83±10.91個;6組對照組細胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):234±8.29個,經(jīng)過配對t檢驗,t值為:4.023.p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計學意義,經(jīng)過沉默后的前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力明顯降低,也證實了干擾片段的沉默抑制作用。1.4結(jié)論經(jīng)過URG11si RNA干擾后沉默的LNCa P細胞在增殖速度、分裂、侵襲能力下降;加快凋亡;腫瘤生物學行為改變,證實URG11si RNA有效性,URG11可能是促進前列腺癌細胞增殖、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的潛在基因。1.5本研究的創(chuàng)新之處通過前期研究,前列腺癌細胞URG11 m RNA蛋白表達水與良性前列腺組織有顯著性差異,尚未有文章對于URG11在前列腺癌生物行為及沉默URG11后的研究,本研究通過篩選實驗等到URG11si RNA有效有效干擾片段SASI-Hs01-00182413及有效濃度50n M/ul,擬運用細胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測沉默URG11在LNCa P細胞表達特性及MTS/CCK-8法檢測沉默后細胞增殖、FCM檢測細胞凋亡及周期、Transwell細胞遷移、侵襲能力等生物學行為,檢驗沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘毎飳W性改變,明確URG11基因在LNCa P細胞的功能。實驗證實了URG11基因可能時前列腺癌細胞治療潛在的基因。
【關(guān)鍵詞】：URG11 URG11siRNA 前列腺癌 前列腺癌基因治療
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
【目錄】：
- 中文摘要3-8
- ABSTRACT8-13
- 前言13-16
- 1.1 前列腺癌流行病學概況13
- 1.2 前列腺癌的篩查及治療現(xiàn)狀13-15
- 1.3 URG11的國內(nèi)外研究進展15-16
- 第一章 URG11siRNA篩選實驗16-26
- 1.實驗材料16-21
- 1.1 URG11siRNA 干擾序列片段及反密碼鏈由 sigma 設計公司提供16-17
- 1.2 實驗方法17-18
- 1.3 細胞培養(yǎng)18
- 1.4 siRNA 篩選轉(zhuǎn)染18-19
- 1.5 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建19
- 1.6 細胞轉(zhuǎn)染19-20
- 1.7 western blotting20-21
- 2.實驗方法21
- 2.1 總蛋白抽提21
- 2.2 蛋白樣品初步定量21
- 3 SDS-PAGE 電泳21
- 4 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移21-22
- 5 免疫印記22
- 6 總 RNA 純度和完整性檢測22-24
- 7 URG11siRNA篩選實驗結(jié)果24-25
- 8 實驗結(jié)果討論25-26
- 第二章 RNA干擾URG11基因表達對LNCAP細胞增殖和調(diào)亡的研究26-35
- 1.構(gòu)建穩(wěn)定沉默內(nèi)源性URG11的前列腺癌細胞株26-29
- 2.Western Blot 檢驗沉默后 LNCAP 細胞的 URG11 蛋白表達情況29-31
- 3.MTS/CCK-8 法檢測細胞增殖31-32
- 4.Transwell 檢測細胞遷移能力32
- 5.流式檢測細胞凋亡32-33
- 6.流式檢測細胞周期33
- 7.細胞遷移實驗（劃痕檢測）33-34
- 8.transwell 檢測細胞侵襲能力34-35
- 第三章 RNA干擾URG11基因表達對LNCAP細胞增殖和調(diào)亡的研究結(jié)果35-52
- 1 前列腺癌細胞系的培養(yǎng)情況35-36
- 2.Real-time-PCR檢驗沉默后LNCaP細胞的URG11mRNA表達情況36-38
- 3.Western Blot檢驗沉默后LNCaP細胞的URG11蛋白表達情況38-40
- 4.CCK-8 檢驗沉默后LNCaP細胞增殖檢測40-41
- 5.CCK-8 檢驗沉默后 LNCaP 細胞增殖檢測結(jié)果41-42
- 6.FCM 細胞周期檢測42-43
- 7.流式沉默后前列腺癌細胞周期結(jié)果43-44
- 8.流式檢測細胞凋亡率44-45
- 9.FCM 沉默后前列腺癌細胞凋亡結(jié)果45-46
- 10.細胞劃痕實驗46-48
- 11.細胞遷移實驗（劃痕檢測）結(jié)果48
- 12.細胞遷移實驗48-50
- 13.Transwell 檢測沉默后前列腺癌細胞遷移能力結(jié)果50
- 14.細胞侵襲實驗50-52
- 15.Transwell 檢測沉默后前列腺癌細胞侵襲能力結(jié)果52
- 第四章 討論52-57
- 全文總結(jié)57-58
- 1 本課題的選題思路及創(chuàng)新性57
- 2 本研究的結(jié)果及其意義57
- 3 本課題中存在的不足及展望57-58
- 結(jié)論58
- 參考文獻58-65
- 實驗主要試劑及儀器65-70
- 附錄 1. 縮略詞表70-71
- 附錄 271-73
- 致謝73
【參考文獻】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條
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，本文編號：1129286
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