本文關(guān)鍵詞：沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞功能的影響

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【摘要】：1.1背景和目的URG11在肝癌、胃癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織證實(shí)比正常組織表達(dá)高[1-5],同時(shí)也在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞黏附、遷移、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移、以及信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)都有關(guān)鍵作用[6-9]。有研究通過(guò)si RNA技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞URG11的表達(dá),胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力受到明顯抑制,而且還可顯著削弱其在體外轉(zhuǎn)移和侵襲能力,以及抑制在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤性和生物學(xué)行為[10-14],腫瘤的生物學(xué)行為明顯受到抑制。經(jīng)過(guò)我們前期研究,證實(shí)了URG11在前列腺癌中比正常前列腺組織表達(dá)有差異,并且URG11表達(dá)強(qiáng)度與其在癌癥的病理等級(jí)、分化程度、TNM及是否轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。在前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞系中URG11 m RNA及蛋白表達(dá)明顯高于前列腺上皮細(xì)胞,且有顯著性差異,在LNCa P系中表達(dá)異常最顯著[15]。然而URG11在前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未闡述,RNA干擾(RNAi)是一種新興的的基因診治方法,是指利用小RNA序列抑制特定基因信號(hào)序列,利用治療序列的si RNA使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失,以達(dá)到某些實(shí)驗(yàn)或治療目的,在腫瘤的基因診治中有光明前途[10-14]。本課題擬擬運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測(cè)沉默URG11在前列腺癌細(xì)胞(LNCa P細(xì)胞系)表達(dá)特性及MTS/CCK-8法、流式檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(劃痕檢測(cè))及Transwell檢測(cè)發(fā)探究沉默URG11基因后對(duì)于LNCa P細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的生物學(xué)行為的改變影響,本研究采用RNAi方法干擾沉默URG11在前列腺癌細(xì)胞的中表達(dá),明確其在PCa中發(fā)生、發(fā)展作用功能,闡明URG11在PCa中發(fā)病變機(jī)制,證實(shí)URG11基因可以作為PCa的基因治療提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn),進(jìn)一步證實(shí)URG11在PCa表達(dá)特性及基因靶向診治有效性,為治療PCa基因治療提供新的路線和理論基礎(chǔ)。1.2方法1.細(xì)胞培養(yǎng),設(shè)計(jì)URG11si RNA干擾序列片段及反密碼鏈(由sigma公司提供)、通過(guò)通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選最合適的URG11si RNA及抑制適合濃度。根據(jù)文獻(xiàn)我們?cè)O(shè)計(jì)URG11si RNA干擾片段(3對(duì)),構(gòu)建含URG11si RNA慢病毒質(zhì)粒載體,將慢病毒載體質(zhì)粒與LNCa P細(xì)胞混合培養(yǎng),用慢病毒質(zhì)粒感染LNCa P細(xì)胞,Real-time-PCR和Western blot鑒定有效的干擾載體及合適濃度。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細(xì)胞株。利用篩選出URG11si RNA特異性干擾片段的質(zhì)粒感染LNCa P細(xì)胞,用含空載質(zhì)粒體的做對(duì)照,通過(guò)Real-time-PCR和Western blot測(cè)定干擾后URG11基因m RNA在細(xì)胞中的表達(dá)。3.沉默URG11對(duì)PCa細(xì)胞生物學(xué)行為改變的影響。MTS/CCK-8法檢測(cè)沉默后列腺癌細(xì)胞增殖;FCM檢測(cè)細(xì)胞方法檢測(cè)沉默后生長(zhǎng)周期及凋亡程度;遷移實(shí)驗(yàn)及Transwell小室檢測(cè)沉默后侵襲及轉(zhuǎn)移能力等其他生物學(xué)行為。1.3結(jié)果1.篩選URG11siRNA特異性干擾片段通過(guò)由sigma公司提供干擾序列片段及反密碼鏈SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT轉(zhuǎn)染URG11高表達(dá)的前列腺癌LNCa P細(xì)胞,利用Real-time-PCR、Western blot及RNA Structure軟件分析得出三條干擾片段各個(gè)濃度的URG11 m RNA表達(dá)能力顯示:SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)對(duì)細(xì)胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24;經(jīng)2-△△Ct法計(jì)算處理,經(jīng)過(guò)與空白組的對(duì)比,LNCa P前列腺癌細(xì)胞中URG11 m RNA表達(dá)抑制率高達(dá)78.25%,經(jīng)方差分析F=952.12,P0.000,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,三個(gè)干擾片段中SASI-Hs01-00182413(50n M/ul)具有良好的抑制URG11效果,SASI-Hs01-00182413片段干擾效率最高、最穩(wěn)定及最有效濃度50n M/ul。2.培養(yǎng)沉默良好的URG11的前列腺癌細(xì)胞株將篩選的有效URG11si RNA干擾片段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LNCa P細(xì)胞株,Real-time-PCR和WB檢測(cè)沉默后的LNCa P的細(xì)胞株,在LNCa P細(xì)胞URG11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分別為31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±0.18;經(jīng)2-△△Ct法計(jì)算處理,經(jīng)過(guò)與空白組的對(duì)比,LNCa P前列腺癌細(xì)胞中URG11 m RNA表達(dá)抑制率高達(dá)78.72%,在PC3前列腺癌細(xì)胞系抑制率為62.01%。根據(jù)干擾后的抑制效果,篩選的URG11si RNA干擾片段及其濃度復(fù)合我們要求,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后也能很好抑制前列腺癌細(xì)胞,兩個(gè)細(xì)胞系中URG11 m RNA明顯降低,經(jīng)方差分析F=867.28,P0.000,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Westernblot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比OD值(95.1285/1993.015),通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默內(nèi)源性LNCa P的前列腺癌細(xì)胞株成功建立。3..MTS/CCK-8法檢測(cè)沉默后的LNCa P細(xì)胞增殖通過(guò)MTS/CCK-8法檢檢測(cè)沉默后的LNCa P細(xì)胞,與對(duì)照組比較,從表5中,我們可以判斷出在0h時(shí)LNCa P細(xì)胞對(duì)URG11增殖敏感性,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t=0.300;p=0.266,,按α=0.05,沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)過(guò)沉默24h/48h/72h后,,表7中經(jīng)過(guò)軟件的計(jì)算,可以經(jīng)過(guò)沉默24h/48h/72h后實(shí)驗(yàn)組的抑制率對(duì)比:7.15%;8.75%;10.75%,對(duì)照組中-0.60%;-0.49%;-0.21%,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為:3.72,p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過(guò)比較,證實(shí)了通過(guò)URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細(xì)胞增殖受到抑制。4.FCM分析沉默后的LNCa P細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析沉默后LNCa P細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡指數(shù),與對(duì)照組比較,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細(xì)胞培育48/72h后,實(shí)驗(yàn)組停留在G1期的百分比分別為:64.13%;66.98%,在四倍體G2及最終分裂期M期細(xì)胞百分比:10.38%、8.14%,對(duì)于對(duì)照組分析,停留在G1期的百分比分別為:55.94%;53.39%,在四倍體G2及最終分裂期M期細(xì)胞百分比:11.28%;9.25%,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),p0.05,按α=0.05,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染沉默后的前列腺癌細(xì)胞培育48/72h后,實(shí)驗(yàn)組在分析軟件上UR+LR細(xì)胞百分比分別為:8.48%;8.83%,對(duì)于對(duì)照組分析,UR+LR細(xì)胞百分比分別為:1.47%;1.55%,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為:6.424;6.357,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在凋亡早晚期分析中,沉默48h后前列腺癌細(xì)胞分別為:2.52%;5.96%,沉默72h后前列腺癌細(xì)胞分別為:2.95%;5.88%,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),p0.05,我們可以認(rèn)為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過(guò)流式細(xì)胞儀分分析數(shù)據(jù)可以證實(shí)通過(guò)URG11si RNA特異性干擾片段沉默URG11后LNCa P細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,LNCaP細(xì)胞凋亡率增加。5.Transwell小室檢測(cè)侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組比較,經(jīng)過(guò)URG11si RNA干擾片段沉默后前列腺癌細(xì)胞在0h、6h、24h、48h的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移分別為:423.53±16.16;420.06±8.4;408.47±16.07;391.46±21.05,對(duì)照組前列腺癌細(xì)胞在0h、6h、24h、48h的細(xì)胞遷移分別為:529.41±12.09;518.48±8.62;451.22±48.19;393.07±15.33;轉(zhuǎn)算為遷移率,實(shí)驗(yàn)組分別為:0.00%;0.82%;3.56%;7.57%,對(duì)照組遷移率分別為0.00%;2.06%;14.77%;25.5%,,經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值分別為:3.786;5.234;5.681,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;經(jīng)過(guò)沉默后的.LNCa P細(xì)胞遷移數(shù)目明顯比對(duì)照組少,經(jīng)過(guò)URG11si RNA轉(zhuǎn)染48h后,6組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):75.17±17.12個(gè);6組對(duì)照組細(xì)胞中平均遷移數(shù)目為(mean±s.d):164.33±20.03個(gè),經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值為:6.73,各組p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染48h后,6組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):142.83±10.91個(gè);6組對(duì)照組細(xì)胞中平均穿孔數(shù)目為(mean±s.d):234±8.29個(gè),經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn),t值為:4.023.p0.05,按α=0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,經(jīng)過(guò)沉默后的前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力明顯降低,也證實(shí)了干擾片段的沉默抑制作用。1.4結(jié)論經(jīng)過(guò)URG11si RNA干擾后沉默的LNCa P細(xì)胞在增殖速度、分裂、侵襲能力下降;加快凋亡;腫瘤生物學(xué)行為改變,證實(shí)URG11si RNA有效性,URG11可能是促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能的潛在基因。1.5本研究的創(chuàng)新之處通過(guò)前期研究,前列腺癌細(xì)胞URG11 m RNA蛋白表達(dá)水與良性前列腺組織有顯著性差異,尚未有文章對(duì)于URG11在前列腺癌生物行為及沉默URG11后的研究,本研究通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)等到URG11si RNA有效有效干擾片段SASI-Hs01-00182413及有效濃度50n M/ul,擬運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染(慢病毒質(zhì)粒)、Real-time-PCR和Western blot檢測(cè)沉默URG11在LNCa P細(xì)胞表達(dá)特性及MTS/CCK-8法檢測(cè)沉默后細(xì)胞增殖、FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期、Transwell細(xì)胞遷移、侵襲能力等生物學(xué)行為,檢驗(yàn)沉默URG11基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生物學(xué)性改變,明確URG11基因在LNCa P細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了URG11基因可能時(shí)前列腺癌細(xì)胞治療潛在的基因。
【關(guān)鍵詞】：URG11 URG11siRNA 前列腺癌 前列腺癌基因治療
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-16
• 1.1 前列腺癌流行病學(xué)概況13
• 1.2 前列腺癌的篩查及治療現(xiàn)狀13-15
• 1.3 URG11的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展15-16
• 第一章 URG11siRNA篩選實(shí)驗(yàn)16-26
• 1.實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 1.1 URG11siRNA 干擾序列片段及反密碼鏈由 sigma 設(shè)計(jì)公司提供16-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-18
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)18
• 1.4 siRNA 篩選轉(zhuǎn)染18-19
• 1.5 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建19
• 1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染19-20
• 1.7 western blotting20-21
• 2.實(shí)驗(yàn)方法21
• 2.1 總蛋白抽提21
• 2.2 蛋白樣品初步定量21
• 3 SDS-PAGE 電泳21
• 4 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移21-22
• 5 免疫印記22
• 6 總 RNA 純度和完整性檢測(cè)22-24
• 7 URG11siRNA篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-25
• 8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論25-26
• 第二章 RNA干擾URG11基因表達(dá)對(duì)LNCAP細(xì)胞增殖和調(diào)亡的研究26-35
• 1.構(gòu)建穩(wěn)定沉默內(nèi)源性URG11的前列腺癌細(xì)胞株26-29
• 2.Western Blot 檢驗(yàn)沉默后 LNCAP 細(xì)胞的 URG11 蛋白表達(dá)情況29-31
• 3.MTS/CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖31-32
• 4.Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力32
• 5.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡32-33
• 6.流式檢測(cè)細(xì)胞周期33
• 7.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕檢測(cè)）33-34
• 8.transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力34-35
• 第三章 RNA干擾URG11基因表達(dá)對(duì)LNCAP細(xì)胞增殖和調(diào)亡的研究結(jié)果35-52
• 1 前列腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)情況35-36
• 2.Real-time-PCR檢驗(yàn)沉默后LNCaP細(xì)胞的URG11mRNA表達(dá)情況36-38
• 3.Western Blot檢驗(yàn)沉默后LNCaP細(xì)胞的URG11蛋白表達(dá)情況38-40
• 4.CCK-8 檢驗(yàn)沉默后LNCaP細(xì)胞增殖檢測(cè)40-41
• 5.CCK-8 檢驗(yàn)沉默后 LNCaP 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果41-42
• 6.FCM 細(xì)胞周期檢測(cè)42-43
• 7.流式沉默后前列腺癌細(xì)胞周期結(jié)果43-44
• 8.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率44-45
• 9.FCM 沉默后前列腺癌細(xì)胞凋亡結(jié)果45-46
• 10.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)46-48
• 11.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕檢測(cè)）結(jié)果48
• 12.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)48-50
• 13.Transwell 檢測(cè)沉默后前列腺癌細(xì)胞遷移能力結(jié)果50
• 14.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)50-52
• 15.Transwell 檢測(cè)沉默后前列腺癌細(xì)胞侵襲能力結(jié)果52
• 第四章 討論52-57
• 全文總結(jié)57-58
• 1 本課題的選題思路及創(chuàng)新性57
• 2 本研究的結(jié)果及其意義57
• 3 本課題中存在的不足及展望57-58
• 結(jié)論58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器65-70
• 附錄 1. 縮略詞表70-71
• 附錄 271-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 謝華紅;劉杰;;URG11在肝癌組織表達(dá)增強(qiáng)并促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年11期

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4 李超;;靜脈麻醉和局麻下經(jīng)直腸行前列腺穿刺活檢診斷前列腺癌研究[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師;2015年06期

5 楊國(guó)強(qiáng);符偉軍;王忠新;王威;朱大慶;費(fèi)翔;曹曉林;高江平;張旭;;12+X法超聲引導(dǎo)下經(jīng)會(huì)陰前列腺穿刺活檢術(shù)35例報(bào)告[J];臨床泌尿外科雜志;2014年12期

6 孫翔;鐘柯兆;羅龍華;錢軍;;定向抗菌預(yù)防法在防治經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢術(shù)后感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2014年15期

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本文編號(hào)：1129286