發(fā)布時(shí)間：2017-11-01 16:30

  本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌中肝激酶B1的表達(dá)及功能研究

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【摘要】：肺癌已是目前我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)導(dǎo)致癌相關(guān)死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤疾病,這些患者中超過(guò)85%為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC),其中最常見(jiàn)的兩種亞型是腺癌(Adenocarcinoma, ADC)和鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma, SCC,其發(fā)病隱匿,大部分患者被診斷時(shí)已處于中晚期,手術(shù)作為最常用的,也是目前最有效的治療手段,但對(duì)于中晚期患者的療效及預(yù)后改善并不理想,且有些患者確診時(shí)已無(wú)法接受手術(shù)治療。而其他的傳統(tǒng)治療手段,如放射性療法、化學(xué)療法等均存在較大副作用,治療效果也并不盡如人意,這就需要去尋找新的治療手段。近年來(lái)針對(duì)腫瘤的基因治療取得諸多突破,也面臨一些問(wèn)題,由于現(xiàn)階段基因治療的載體系統(tǒng)在人體內(nèi)既不能特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞,也不能使治療基因在腫瘤內(nèi)高效表達(dá),所以治療基因的生物學(xué)效應(yīng)難以得到發(fā)揮,導(dǎo)致其抗腫瘤能力并未達(dá)到預(yù)期效果。并且腫瘤的發(fā)生是包含多種基因改變的多步驟過(guò)程,單獨(dú)調(diào)節(jié)某一基因難以消滅腫瘤。因此,尋求能對(duì)肺癌起到高效抑制作用的抑癌基因和靶向性強(qiáng)、安全性好、表達(dá)效率高的載體就成為了基因治療策略需要解決的問(wèn)題。多項(xiàng)研究表明肝激酶Bl(Liver kinaseB1, LKB1)及人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其基因的缺失或下調(diào)會(huì)誘使NSCLC發(fā)生并極大促進(jìn)其發(fā)病進(jìn)程。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)了LKB1及PTEN兩抑癌基因在NSCLC患者中的表達(dá)情況并結(jié)合臨床信息分析其與NSCLC發(fā)生發(fā)展的潛在關(guān)系；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)、qPCR及western blot方法檢測(cè)了A549,NCI-H23、 NCI-H157.XWLC-05四株NSCLC細(xì)胞系和一株SCLC細(xì)胞系NCI-H446中LKB1及PTEN的表達(dá)水平；通過(guò)AdMax系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒過(guò)表達(dá)載體Ad-LKB1,將目的基因?qū)敕伟┘?xì)胞并實(shí)現(xiàn)LKB1在肺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá),并在體外細(xì)胞水平通過(guò)CCK-8增殖活性檢測(cè)及細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)初步探究LKB1對(duì)肺癌細(xì)胞,尤其是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)在所檢測(cè)的74例NSCLC患者中,有35例為PTEN陽(yáng)性表達(dá)(47.3%),另有52例為L(zhǎng)KB1陽(yáng)性表達(dá)(70.3%)；該兩基因的表達(dá)水平與患者性別、年齡、肺癌的病理組織亞型等無(wú)顯著差異(P0.05),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍組織侵犯、臨床分期等具有顯著差異(P0.05)；聯(lián)合LKB1及PTEN表達(dá)水平與患者發(fā)病惡性程度分析發(fā)現(xiàn),LKB1與PTEN共同表達(dá)水平越高,其腫瘤惡性程度越低(P0.05)。在成功構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-LKB1后,我們發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)LKB1基因,可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性,且在表型為L(zhǎng)KB1-/PTEN-的XWLC-05細(xì)胞中,抑制作用最為顯著,而在表型為L(zhǎng)KB1+PTEN+的NCI-H23細(xì)胞中,其增殖抑制作用相對(duì)較弱；在劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,相較于感染Ad-null的對(duì)照組細(xì)胞,感染Ad-LKB1的肺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力被顯著抑制。本研究結(jié)果證實(shí)了LKB1及PTEN在NSCLC患者中存在一定的表達(dá)下調(diào),且發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)于肺癌的惡性進(jìn)展可能存在潛在的協(xié)同作用；通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),初步證實(shí)了抑癌基因LKB1對(duì)肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制增殖及遷移作用。提示LKB1及PTEN可作為潛在的肺癌預(yù)后標(biāo)志物；LKB1具有靶向治療靶點(diǎn)的潛力,對(duì)應(yīng)用于新型基因治療方案提供了一定參考價(jià)值。對(duì)于LKB1抑制肺癌細(xì)胞活性具體分子機(jī)制及其與PTEN在肺癌中的協(xié)同作用還有待于進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 肝激酶B1 腺病毒載體 過(guò)表達(dá) 肺癌細(xì)胞系
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-16
• 縮略表16-19
• 第一章 緒論19-33
• 1.1 肺癌近年發(fā)展19
• 1.2 非小細(xì)胞肺癌病理亞型及分期19-23
• 1.3 非小細(xì)胞肺癌治療現(xiàn)狀23-25
• 1.4 mTOR信號(hào)通路25-28
• 1.5 LKB1肺癌的相關(guān)性28-32
• 1.6 研究目的及意義32-33
• 第二章 PTEN和LKB1在臨床上非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)33-43
• 2.1 引言33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料33-36
• 2.2.1 技術(shù)路線33
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本33-35
• 2.2.3 主要試劑35
• 2.2.4 主要設(shè)備35-36
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 2.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTEN和LKB1表達(dá)36
• 2.3.2 結(jié)果判定36-37
• 2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37
• 2.4 結(jié)果37-41
• 2.4.1 非小細(xì)胞肺癌中PTEN和LKB1的表達(dá)37-39
• 2.4.2 PTEN和LKB1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌惡性程度的關(guān)系39-41
• 2.5 討論41-43
• 第三章 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LKB1的過(guò)表達(dá)43-67
• 3.1 引言43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料43-50
• 3.2.1 技術(shù)路線43-44
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本44-48
• 3.2.3 主要試劑48-49
• 3.2.4 主要儀器49-50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法50-59
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)50-51
• 3.3.2 細(xì)胞中LKB1及PTEN本底表達(dá)水平檢測(cè)51-54
• 3.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染54
• 3.3.4 LKB1過(guò)表達(dá)檢測(cè)54-59
• 3.4 結(jié)果59-64
• 3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)59-60
• 3.4.2 細(xì)胞本底表達(dá)水平檢測(cè)ICC檢測(cè)各細(xì)胞株LKB1及PTEN表達(dá)60-62
• 3.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及LKB1過(guò)表達(dá)檢測(cè)62-64
• 3.5 討論64-67
• 第四章 腺病毒載體構(gòu)建67-85
• 4.1 引言67-68
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料68-73
• 4.2.1 技術(shù)路線68
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本68-71
• 4.2.3 主要試劑71-72
• 4.2.4 主要設(shè)備72-73
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法73-78
• 4.3.1 目的基因擴(kuò)增73-74
• 4.3.2 構(gòu)建攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒74-75
• 4.3.3 重組腺病毒過(guò)表達(dá)載體包裝75-76
• 4.3.4 收集病毒及擴(kuò)增76
• 4.3.5 重組腺病毒TCID50測(cè)定76-78
• 4.4 結(jié)果78-82
• 4.4.1 LKB1基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建78-80
• 4.4.2 重組腺病毒過(guò)表達(dá)載體包裝和收毒80-81
• 4.4.3 重組腺病毒滴度測(cè)定81-82
• 4.5 討論82-85
• 第五章 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)85-93
• 5.1 引言85
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料85-87
• 5.2.1 技術(shù)路線85
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本85-86
• 5.2.3 主要試劑86
• 5.2.4 主要設(shè)備86-87
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法87-89
• 5.3.1 腺病毒感染肺癌細(xì)胞87
• 5.3.2 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)87-88
• 5.3.3 檢測(cè)遷移能力改變88-89
• 5.4 結(jié)果89-90
• 5.4.1 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)各細(xì)胞株感染ad-LKB1后的增殖影響89
• 5.4.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力改變89-90
• 5.5 討論90-93
• 致謝93-95
• 參考文獻(xiàn)95-101
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文101

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