本文關鍵詞：CD44抗體對急性髓系白血病干細胞骨髓微環(huán)境作用機制的體外研究

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【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是造血系統(tǒng)的髓系幼稚細胞惡性增殖而產(chǎn)生異常造血的一種克隆性疾病。骨髓(bone marrow,BM)微環(huán)境內(nèi)存在著一群數(shù)量極少但具有自我更新能力的白血病干細胞(leukemia stem cell,LSC),能夠啟動并保持AML的惡性克隆,大多數(shù)LSC處于G0期,可免受針對細胞周期的傳統(tǒng)化療方案的殺傷而成為AML患者復發(fā)的根源。研究已知CD44抗體通過干擾AML-LSC與骨髓微環(huán)境間的作用而清除LSC,正常造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)則可‘逃逸’CD44抗體的作用。我們前期的體外實驗結(jié)果顯示CD44抗體(A3D8)可抑制LSC與BM基質(zhì)細胞(stromal cells,SC)/成骨細胞(osteoblast,OB)間的粘附,且以后者為著,而對正常HSC與SC/OB無影響;劃痕及CCK-8實驗分別證實CD44抗體降低了OB的體外遷移和增殖能力,因此推測CD44抗體可能對骨髓微環(huán)境具有破壞作用。故本研究目的在于證實正常HSC和LSC對相同CD44抗體具有不同的反應性,旨在探討CD44抗體靶向清除LSC的具體作用機制,為AML的臨床治療提供有利的理論依據(jù)。方法:培養(yǎng)人巨核細胞白血病細胞系M07e、從AML患者骨髓中提取分選CD34+CD38-細胞(AML CD34+CD38-),均用以替代LSC;從新生足月胎兒臍帶血中提取分選CD34+細胞(CB CD34+)、培養(yǎng)人正常成骨細胞系hFOB1.19,分別替代骨髓微環(huán)境中的正常HSC和OB。本課題利用劃痕加兩種細胞分別接觸共培養(yǎng)和Transwell非接觸共培養(yǎng)實驗,觀察與HSC/LSC分別共培養(yǎng)時A3D8對OB遷移功能的影響。Wnt/β-catenin信號途徑在干細胞生存、自我更新的維持中發(fā)揮著重要作用,為此免疫組化定性檢測HSC/LSC和OB細胞內(nèi)β-catenin的表達情況;利用Western blot定量檢測A3D8作用下,HSC/LSC及OB細胞內(nèi)β-catenin的蛋白表達量,以及與HSC/LSC共培養(yǎng)時OB中β-catenin的表達變化;通過細胞免疫熒光(IF)的方法觀察A3D8對OB內(nèi)β-catenin細胞核定位的影響作用。結(jié)果:1.與CB CD34+細胞共培養(yǎng)24h后hFOB1.19受A3D8(5μg/ml)抑制的遷移能力得以修復,隨著時間的推移,hFOB1.19細胞逐漸向劃痕間隙遷移,寬度明顯減小;但是Transwell非接觸共培養(yǎng)后,hFOB1.19細胞向劃痕間隙遷移不明顯,提示這種修復是通過兩種細胞直接接觸來完成的;相反,M07e/AML CD34+CD38-細胞卻不具備這種修復功能。2.hFOB1.19中β-catenin表達呈陽性,陽性率高達100%,且其表達量明顯高于M07e/AML CD34+CD38-細胞和CB CD34+細胞,二者分別呈陰性和極低表達。3.在5μg/ml藥物濃度下,隨著A3D8處理時間的延長(0h,24h,48h,72h),越來越明顯地降低hFOB1.19中β-catenin蛋白的表達,且呈時間依賴性,β-catenin/GAPDH灰度比值分別為(98.52±6.04)%,(94.19±10.05)%,(79.86±13.96)%,(44.94±9.40)%,作用48h和72h后差異顯著(P0.05);但A3D8對CB CD34+和M07e細胞內(nèi)β-catenin的表達均無影響。4.在5μg/ml藥物濃度下,細胞接觸共培養(yǎng)48h后hFOB1.19細胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(β-catenin/GAPDH灰度比值)分別為:OB組(92.40±12.74)%,OB+A3D8組(77.21±9.97)%,OB+CB CD34++A3D8組(92.75±10.79)%,OB+M07e/AML CD34+CD38-+A3D8組(69.31±9.11)%,與CB CD34+細胞接觸共培養(yǎng)后hFOB1.19受A3D8抑制的β-catenin蛋白表達量逆轉(zhuǎn)回升(P0.05);而M07e/AML CD34+CD38-細胞卻不具備這種修復能力。5.在5μg/ml藥物濃度下,隨著A3D8處理時間的延長(0h,24h,48h,72h),其逐漸降低了hFOB1.19中β-catenin細胞核定位,且具有時間依賴性,于48h之后作用較為明顯。結(jié)論:1.CD44抗體可通過干擾骨髓微環(huán)境中OB的功能特異性殺傷LSC,但正常HSC則可修復OB受損傷的功能,而不受CD44抗體的影響。2.CD44抗體可通過下調(diào)OB細胞內(nèi)β-catenin的表達及其核定位來影響OB的遷移及增殖等功能,進而特異性破壞LSC與其BM微環(huán)境的相互作用。3.CD44抗體可干擾Wnt/β-catenin信號通路靶向清除LSC,同時正常HSC通過修復作用實現(xiàn)自我保護而免受損害。
【關鍵詞】：骨髓微環(huán)境 白血病干細胞 正常造血干細胞 成骨細胞 CD44Wnt/β-catenin 信號通路
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1 對象和方法15-29
• 1.1 實驗對象及材料15-19
• 1.1.1 細胞系來源15
• 1.1.2 原代細胞來源15
• 1.1.3 主要試劑耗材15-16
• 1.1.4 主要液體配制16-18
• 1.1.5 主要儀器設備18-19
• 1.2 實驗方法19-28
• 1.2.1 細胞系的培養(yǎng)19-20
• 1.2.2 原代細胞的分離提取20-22
• 1.2.3 劃痕+兩種細胞共培養(yǎng)實驗22-23
• 1.2.4 ELISA檢測A3D8對成骨細胞SDF-1表達分泌的影響23-24
• 1.2.5 免疫組織化學（IHC）定性檢測細胞內(nèi)β-catenin 的表達24-25
• 1.2.6 CD44單克隆抗體A3D8處理h FOB1.19、M07e/AML CD34~+CD38~-和 CB CD34~+細胞25-26
• 1.2.7 Western Blot 檢測 A3D8對細胞內(nèi)β-catenin蛋白表達量的影響26-27
• 1.2.8 細胞免疫熒光（IF）檢測 h FOB1.19 細胞β-catenin 核定位情況27-28
• 1.3 統(tǒng)計學方法28-29
• 2 結(jié)果29-38
• 2.1 分離原代細胞的鑒定29-30
• 2.2 劃痕+共培養(yǎng)實驗結(jié)果30-33
• 2.3 ELISA檢測結(jié)果33
• 2.4 免疫組化結(jié)果33-34
• 2.5 Western Blot結(jié)果34-37
• 2.6 細胞免疫熒光檢測37-38
• 3 討論38-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 綜述 急性髓系白血病干細胞與骨髓微環(huán)境的相關性研究進展52-66
• 綜述參考文獻60-66
• 致謝66-67
• 個人簡歷67

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