本文關(guān)鍵詞：Th22細(xì)胞在肝癌惡性腹水中募集和分化機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：研究輔助性T淋巴細(xì)胞-22(Th22)細(xì)胞在惡性腹水(MA)及同源外周血中的分布情況及其表型特征,探討Th22細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的分化過程和其募集浸潤(rùn)至腹腔積液的機(jī)制。方法：使用標(biāo)準(zhǔn)腹腔穿刺取得37例肝癌并發(fā)惡性腹水患者腹腔積液800m1,并同時(shí)抽取外周血標(biāo)本15m1,納入病例均不曾接受抗腫瘤治療,未使用糖皮質(zhì)激素和甾體類抗炎藥。抽取10例健康對(duì)照者15m1外周血,使用密度梯度離心法獲得淋巴細(xì)胞并立即檢測(cè)T細(xì)胞亞群Th17、Th22細(xì)胞在MA和外周血中的分布比例。使用人抗CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR10、 CD45RA、CD45R0、CD62L單克隆抗體對(duì)Th22細(xì)胞膜表面染色標(biāo)記,破膜劑破膜后使用抗IL-22、抗IL-17和IFN-γ單克隆抗體對(duì)Th22細(xì)胞內(nèi)抗原做熒光染色標(biāo)記。使用Naive CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒從MA和外周血中陰性分選出CD4+T細(xì)胞,24孔板中單獨(dú)或組合加入外源性細(xì)胞因子：TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(50ng/ml)、IL-1β (20ng/ml)、IL-6(100 ng/ml),在37℃、5%CO2下培養(yǎng)7d后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-22染色,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Th22細(xì)胞比例,TNF-αIL-6條件下刺激7組初始CD4+T細(xì)胞分化,37℃、5%CO2條件培養(yǎng)0～7天,每天檢測(cè)一組Th22細(xì)胞比例；在TNF-α50 ng/ml濃度下,向5組初始CD4+T細(xì)胞中加入5種不同濃度(Ong/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)刺激,7d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th22細(xì)胞比例。在外周血中提取初始CD4+T細(xì)胞,加入趨化小室上層,下層加入離心提取凍存的MA上清液,培養(yǎng)后收集下層小室細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-22染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞比例。將外周血中分選出的初始CD4+T細(xì)胞加入上層趨化小室。在下層加入之前離心提取凍存的MA上清液并置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中3h。收集下層小室細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IL-22染色,使用流式細(xì)胞儀分析。部分實(shí)驗(yàn)組加入抗CC類趨化因子20(CCL20)、抗CCL22、抗CCL27單克隆抗體100 ng/ml,或三者組合以期阻斷趨化效應(yīng),使用流式細(xì)胞儀分析Th22比例,計(jì)算趨化指數(shù)。結(jié)果：MA中Th22細(xì)胞的比例(3.22%±0.4%,n=37)明顯高于對(duì)應(yīng)外周血(0.79%±0.2%,n=37,P0.01)和健康對(duì)照組(0.63%±0.11%,n=10,P0.01),Thl7細(xì)胞在MA中比例(3.30%±0.18%)也明顯高于對(duì)應(yīng)外周血(0.79%±0.15%,n=37,P0.01)及健康對(duì)照組(0.67±0.12%,n=10,P0.01),且兩種細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P0.01)。MA和外周血中的Th22細(xì)胞表達(dá)CD45RA(10.51%±0.72%vs 18.20%±0.78%,P0.01)、CD62L(7.05%±0.49%vs 13.66%±0.68%,P0.01)、CCR3(5.77%±0.50%vs5.51%±0.53,P0.05)、CCR5(9.21%±0.82%vs10.84%±0.71,P0.01)水平較低,CD45R0(83.34%±0.96%vs80.08%±1.14%,P0.01)、表達(dá)水平較高。較高水平表達(dá)CCR4(72.48% ±1.74%vs68.70%±1.61,P0.05).CCR6(83.88%±1.68%vs85.61%±1.61, P0.05).CCR10(88.13%±1.24%vs89.23%±1.31,P0.05),CCR7為(52.61%±2.67%vs42.33%±2.44%,P0.05)。CD4+T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化過程中,白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α).IL-1β起促進(jìn)分化作用,干擾素-γ(IFN-γ)起抑制分化作用,且Th22細(xì)胞受IL-6的促分化作用呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴規(guī)律。MA上清液對(duì)外周血Th22細(xì)胞有明顯的趨化效應(yīng),加入抗CCL20、抗CCL22、抗CCL27單克隆抗體則明顯阻斷此趨化作用。結(jié)論：MA中的趨化因子與炎癥細(xì)胞因子在腹膜腔內(nèi)共同作用使得MA中Th22細(xì)胞比例明顯高于外周血,Th22細(xì)胞可能參與MA的發(fā)病過程并發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：Th22細(xì)胞 肝癌 惡性腹水 趨化 分化
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-5
• 英文縮略詞匯對(duì)照表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-22
• 結(jié)果22-30
• 討論30-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-45
• 綜述-CD4~+T細(xì)胞亞群的分化調(diào)節(jié)及其對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤免疫作用研究的新進(jìn)展45-63
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64

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