本文關鍵詞：HBV編碼HBV-miR-2通過下調SMAD4促進肝癌細胞惡性行為

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【摘要】：目的:肝細胞肝癌(HCC)是目前最常見的腫瘤之一,具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前研究表明HCC的發(fā)生受到多種高危因素的影響,其中乙型肝炎病毒(HBV)的感染占到了肝癌發(fā)病原因的80%。HBV持續(xù)性感染誘導的肝細胞肝癌是目前最常見的肝癌亞型,并且HBV相關肝癌的惡性程度較高,且其發(fā)展機制仍有待深入探索。研究表明細胞內的micro RNAs可以通過促進細胞的惡性行為的方式參與HCC的發(fā)展。然而,HBV本身是否編碼miRNA且其在肝癌發(fā)展中發(fā)揮的作用還不清楚。為了解析HBV持續(xù)性感染誘導HCC發(fā)展的分子機制,本實驗室利用solexa深度測序對HBV陰性和HBV陽性肝癌組織中差異表達的miRNA進行了分析,得到了一條與HBV基因組同源的約22nt的小片段miRNA分子,命名為HBV-miR-2。本研究擬驗證HBV編碼的HBV-miR-2的存在并探究其在肝癌細胞中的功能及作用機制。方法:為了確定HBV-miR-2的存在,通過RT-qPCR技術在HBV陽性的肝癌組織和血清樣本中檢測HBV-miR-2的表達;通過Northern blot技術在HBV陽性的Hep G2.2.15細胞中進一步確定HBV-miR-2的表達。然后,通過MTT、平板克隆形成實驗、Transwell遷移和侵襲實驗分析HBV-miR-2對肝癌細胞惡性行為的影響;為了解析HBV-miR-2的具體作用機制,我們利用生物信息學方法預測并結合相關的功能分析選定SMAD4作為HBV-miR-2的候選靶基因,并通過熒光報告載體實驗、RT-q PCR和Western blot分析驗證HBV-miR-2對SMAD4的靶定和調控作用。隨后,我們分析了靶基因SMAD4對肝癌細胞惡性行為的影響,并利用挽救實驗確定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因,從而闡明HBV-miR-2發(fā)揮作用的下游分子機制。結果:RT-qPCR檢測結果表明HBV陽性的肝癌組織和血清樣本中能夠檢測到HBV-miR-2,但是在HBV陰性肝癌組織和血清樣本中沒有檢測到HBV-miR-2的存在。Northern blot實驗在Hep G2.2.15細胞中能夠檢測到HBV-miR-2,但在Hep G2細胞中未檢測到HBV-miR-2。功能性實驗證實HBV-miR-2促進肝癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。熒光報告載體、RT-q PCR和Western blot實驗表明HBV-miR-2直接靶定并負向調控SMAD4的表達。功能學實驗表明SMAD4抑制肝癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。挽救實驗進一步確定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因。結論:本研究發(fā)現并驗證了HBV編碼的miRNA——HBV-miR-2的存在。HBV-miR-2能夠促進肝癌細胞體內外生長轉移惡性行為。SMAD4作為HBV-miR-2的直接的功能性靶基因,能夠抑制肝癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。
【關鍵詞】：HBV miRNA 肝細胞肝癌 細胞增殖 侵襲 SMAD4
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-12
• 前言12-16
• 研究現狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、HBV編碼HBV-miR-2的確定16-26
• 1.1 對象和方法16-22
• 1.1.1 實驗材料16-17
• 1.1.2 實驗方法17-22
• 1.2 結果22-25
• 1.2.1 HBV-miR-2的位置及二級結構22
• 1.2.2 HBV陽性肝癌組織中HBV-miR-2的表達22-23
• 1.2.3 HBV陽性血清樣本中HBV-miR-2的表達23-24
• 1.2.4 Northern blot確定HBV陽性細胞中HBV-miR-2的存在24
• 1.2.5 不同肝癌細胞系中HBV-miR-2的表達24-25
• 1.3 討論25
• 1.4 小結25-26
• 二、HBV-miR-2對肝癌細胞惡性行為的影響26-38
• 2.1 對象和方法26-32
• 2.1.1 實驗材料26-27
• 2.1.2 實驗方法27-32
• 2.2 結果32-36
• 2.2.1 HBV-miR-2過表達和封閉質粒的有效性驗證32-33
• 2.2.2 HBV-miR-2促進肝癌細胞的生長33-34
• 2.2.3 HBV-miR-2促進肝癌細胞平板克隆形成34-35
• 2.2.4 HBV-miR-2抑制肝癌細胞凋亡35
• 2.2.5 HBV-miR-2促進肝癌細胞遷移和侵襲能力35-36
• 2.2.6 HBV-miR-2促進肝癌細胞上皮間質轉化（EMT）36
• 2.3 討論36-37
• 2.4 小結37-38
• 三、HBV-miR-2靶基因的確定38-43
• 3.1 對象和方法38-40
• 3.1.1 實驗材料38
• 3.1.2 實驗方法38-40
• 3.2 結果40-42
• 3.2.1 HBV-miR-2候選靶基因的預測40-41
• 3.2.2 HBV-miR-2直接靶定SMAD4的 3’UTR區(qū)41
• 3.2.3 HBV-miR-2抑制SMAD4的mRNA和蛋白表達41-42
• 3.3 小結42-43
• 四、SMAD4對肝癌細胞惡性行為的影響43-50
• 4.1 對象和方法43-45
• 4.1.1 實驗材料43
• 4.1.2 實驗方法43-45
• 4.2 結果45-49
• 4.2.1 SMAD4在不同肝癌細胞中的表達水平45-46
• 4.2.2 SMAD4過表達和敲降質粒有效性驗證46-47
• 4.2.3 SMAD4抑制肝癌細胞的增殖能力47
• 4.2.4 SMAD4促進肝癌細胞凋亡47-48
• 4.2.5 SMAD4抑制肝癌細胞的遷移侵襲能力48-49
• 4.2.6 SMAD4抑制肝癌細胞的上皮間質轉化（EMT）過程49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結50
• 五、SMAD4對HBV-miR-2惡性行為的挽救作用50-58
• 5.1 對象和方法51-53
• 5.1.1 實驗材料51
• 5.1.2 實驗方法51-53
• 5.2 結果53-56
• 5.2.1 SMAD4過表達能夠挽救HepG2細胞中HBV-miR-2誘導的SMAD4低表達53-54
• 5.2.2 過表達SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導的HepG2細胞活性變化54
• 5.2.3 過表達SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導的HepG2細胞凋亡抑制54-55
• 5.2.4 過表達SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導的HepG2細胞遷移侵襲能力變化55
• 5.2.5 過表達SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導的HepG2細胞EMT變化55-56
• 5.3 討論56-57
• 5.4 小結57-58
• 結論58-60
• 參考文獻60-66
• 發(fā)表文章和參加科研情況說明66-67
• 附錄67-68
• 綜述 miRNA與HBV感染相關的疾病68-83
• 綜述參考文獻76-83
• 致謝83-84
• 個人簡歷84

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1 隋振華;HBV編碼HBV-miR-2通過下調SMAD4促進肝癌細胞惡性行為[D];天津醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：1120229