本文關(guān)鍵詞：HBV編碼HBV-miR-2通過(guò)下調(diào)SMAD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性行為

  更多相關(guān)文章： HBV miRNA 肝細(xì)胞肝癌 細(xì)胞增殖 侵襲 SMAD4

【摘要】：目的:肝細(xì)胞肝癌(HCC)是目前最常見(jiàn)的腫瘤之一,具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前研究表明HCC的發(fā)生受到多種高危因素的影響,其中乙型肝炎病毒(HBV)的感染占到了肝癌發(fā)病原因的80%。HBV持續(xù)性感染誘導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌是目前最常見(jiàn)的肝癌亞型,并且HBV相關(guān)肝癌的惡性程度較高,且其發(fā)展機(jī)制仍有待深入探索。研究表明細(xì)胞內(nèi)的micro RNAs可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的惡性行為的方式參與HCC的發(fā)展。然而,HBV本身是否編碼miRNA且其在肝癌發(fā)展中發(fā)揮的作用還不清楚。為了解析HBV持續(xù)性感染誘導(dǎo)HCC發(fā)展的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)室利用solexa深度測(cè)序?qū)BV陰性和HBV陽(yáng)性肝癌組織中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了分析,得到了一條與HBV基因組同源的約22nt的小片段miRNA分子,命名為HBV-miR-2。本研究擬驗(yàn)證HBV編碼的HBV-miR-2的存在并探究其在肝癌細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制。方法:為了確定HBV-miR-2的存在,通過(guò)RT-qPCR技術(shù)在HBV陽(yáng)性的肝癌組織和血清樣本中檢測(cè)HBV-miR-2的表達(dá);通過(guò)Northern blot技術(shù)在HBV陽(yáng)性的Hep G2.2.15細(xì)胞中進(jìn)一步確定HBV-miR-2的表達(dá)。然后,通過(guò)MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分析HBV-miR-2對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響;為了解析HBV-miR-2的具體作用機(jī)制,我們利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并結(jié)合相關(guān)的功能分析選定SMAD4作為HBV-miR-2的候選靶基因,并通過(guò)熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、RT-q PCR和Western blot分析驗(yàn)證HBV-miR-2對(duì)SMAD4的靶定和調(diào)控作用。隨后,我們分析了靶基因SMAD4對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響,并利用挽救實(shí)驗(yàn)確定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因,從而闡明HBV-miR-2發(fā)揮作用的下游分子機(jī)制。結(jié)果:RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明HBV陽(yáng)性的肝癌組織和血清樣本中能夠檢測(cè)到HBV-miR-2,但是在HBV陰性肝癌組織和血清樣本中沒(méi)有檢測(cè)到HBV-miR-2的存在。Northern blot實(shí)驗(yàn)在Hep G2.2.15細(xì)胞中能夠檢測(cè)到HBV-miR-2,但在Hep G2細(xì)胞中未檢測(cè)到HBV-miR-2。功能性實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBV-miR-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。熒光報(bào)告載體、RT-q PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明HBV-miR-2直接靶定并負(fù)向調(diào)控SMAD4的表達(dá)。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明SMAD4抑制肝癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了HBV編碼的miRNA——HBV-miR-2的存在。HBV-miR-2能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移惡性行為。SMAD4作為HBV-miR-2的直接的功能性靶基因,能夠抑制肝癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。
【關(guān)鍵詞】：HBV miRNA 肝細(xì)胞肝癌 細(xì)胞增殖 侵襲 SMAD4
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)11-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、HBV編碼HBV-miR-2的確定16-26
• 1.1 對(duì)象和方法16-22
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 1.2 結(jié)果22-25
• 1.2.1 HBV-miR-2的位置及二級(jí)結(jié)構(gòu)22
• 1.2.2 HBV陽(yáng)性肝癌組織中HBV-miR-2的表達(dá)22-23
• 1.2.3 HBV陽(yáng)性血清樣本中HBV-miR-2的表達(dá)23-24
• 1.2.4 Northern blot確定HBV陽(yáng)性細(xì)胞中HBV-miR-2的存在24
• 1.2.5 不同肝癌細(xì)胞系中HBV-miR-2的表達(dá)24-25
• 1.3 討論25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、HBV-miR-2對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響26-38
• 2.1 對(duì)象和方法26-32
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-32
• 2.2 結(jié)果32-36
• 2.2.1 HBV-miR-2過(guò)表達(dá)和封閉質(zhì)粒的有效性驗(yàn)證32-33
• 2.2.2 HBV-miR-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)33-34
• 2.2.3 HBV-miR-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞平板克隆形成34-35
• 2.2.4 HBV-miR-2抑制肝癌細(xì)胞凋亡35
• 2.2.5 HBV-miR-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力35-36
• 2.2.6 HBV-miR-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）36
• 2.3 討論36-37
• 2.4 小結(jié)37-38
• 三、HBV-miR-2靶基因的確定38-43
• 3.1 對(duì)象和方法38-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2 結(jié)果40-42
• 3.2.1 HBV-miR-2候選靶基因的預(yù)測(cè)40-41
• 3.2.2 HBV-miR-2直接靶定SMAD4的 3’UTR區(qū)41
• 3.2.3 HBV-miR-2抑制SMAD4的mRNA和蛋白表達(dá)41-42
• 3.3 小結(jié)42-43
• 四、SMAD4對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的影響43-50
• 4.1 對(duì)象和方法43-45
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 4.2 結(jié)果45-49
• 4.2.1 SMAD4在不同肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平45-46
• 4.2.2 SMAD4過(guò)表達(dá)和敲降質(zhì)粒有效性驗(yàn)證46-47
• 4.2.3 SMAD4抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力47
• 4.2.4 SMAD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡47-48
• 4.2.5 SMAD4抑制肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力48-49
• 4.2.6 SMAD4抑制肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結(jié)50
• 五、SMAD4對(duì)HBV-miR-2惡性行為的挽救作用50-58
• 5.1 對(duì)象和方法51-53
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料51
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 5.2 結(jié)果53-56
• 5.2.1 SMAD4過(guò)表達(dá)能夠挽救HepG2細(xì)胞中HBV-miR-2誘導(dǎo)的SMAD4低表達(dá)53-54
• 5.2.2 過(guò)表達(dá)SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活性變化54
• 5.2.3 過(guò)表達(dá)SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡抑制54-55
• 5.2.4 過(guò)表達(dá)SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力變化55
• 5.2.5 過(guò)表達(dá)SMAD4能夠挽救HBV-miR-2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞EMT變化55-56
• 5.3 討論56-57
• 5.4 小結(jié)57-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 發(fā)表文章和參加科研情況說(shuō)明66-67
• 附錄67-68
• 綜述 miRNA與HBV感染相關(guān)的疾病68-83
• 綜述參考文獻(xiàn)76-83
• 致謝83-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷84

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 隋振華;HBV編碼HBV-miR-2通過(guò)下調(diào)SMAD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性行為[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1120229