本文關(guān)鍵詞：GAB調(diào)控端粒酶組裝及腫瘤細(xì)胞衰老的研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)胞衰老 端粒酶 GAB BRCT結(jié)構(gòu)域

【摘要】：細(xì)胞衰老(Cell senescence)是處于活性生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞脫離細(xì)胞周期且不可逆的喪失增殖能力后所進(jìn)入的一種生長(zhǎng)停滯的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),是正常細(xì)胞的必然歸宿,這種現(xiàn)象在生物體中是普遍存在的。細(xì)胞衰老主要分為復(fù)制性衰老與脅迫誘導(dǎo)的早熟性衰老,本研究則重點(diǎn)討論細(xì)胞復(fù)制性衰老。細(xì)胞在復(fù)制性衰老過(guò)程中會(huì)發(fā)生許多變化,如細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩、細(xì)胞周期阻滯、端�？s短、DNA損傷,但是其中最重要的變化就是端�？s短,端�？s短被認(rèn)為是DNA復(fù)制性衰老的根本原因。目前發(fā)現(xiàn)的能夠阻滯細(xì)胞復(fù)制性衰老、防止端粒縮短促進(jìn)端粒延長(zhǎng)的細(xì)胞大多為腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞,其延長(zhǎng)端粒的機(jī)制主要有兩種:(1)依賴延長(zhǎng)端粒的酶即端粒酶來(lái)延長(zhǎng)端粒;(2)通過(guò)ALT途徑延長(zhǎng)端粒,其中ALT途徑主要發(fā)生于一些缺乏端粒酶但表達(dá)hTR的細(xì)胞中,它們能通過(guò)重組的方式延長(zhǎng)端粒,而表達(dá)端粒酶的細(xì)胞則主要依靠端粒酶去延伸端粒。調(diào)控端粒酶活性的方式有許多種,可以在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控hTERT、hTR、Dyskerin等端粒酶復(fù)合體的組分,也可以通過(guò)調(diào)控端粒酶的組裝而調(diào)控端粒酶。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核仁內(nèi)存在一種蛋白—GAB,它就是通過(guò)調(diào)控端粒酶組裝而調(diào)控端粒酶活性,最終調(diào)控端粒長(zhǎng)度導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制性衰老。目前的研究對(duì)于端粒酶組裝的分子機(jī)制闡述得不夠清晰,新的調(diào)控蛋白與調(diào)控機(jī)制有待發(fā)現(xiàn),其在細(xì)胞復(fù)制性衰老中的功能和意義有待明確。我們實(shí)驗(yàn)室前期在研究GAB基因時(shí)發(fā)現(xiàn),在敲低GAB的穩(wěn)定細(xì)胞系中,隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減緩,且細(xì)胞逐漸變大變扁平,因此,我們猜測(cè)細(xì)胞可能發(fā)生了衰老。于是我們?cè)诙喾N端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中敲低GAB后測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞生長(zhǎng)速度都有減緩,但是在端粒酶陰性的U2OS細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GAB或者h(yuǎn)TERT或者GAB與hTERT共轉(zhuǎn)都不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)速度。同時(shí)我們針對(duì)這些端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了BrdU摻入實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯在了G1/S期;后來(lái)我們?cè)贛CF-7細(xì)胞中構(gòu)建長(zhǎng)期穩(wěn)定敲低GAB的單克隆細(xì)胞系,通過(guò)SA-β-Gal染色發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期穩(wěn)定敲低GAB后細(xì)胞發(fā)生衰老,而長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)GAB的細(xì)胞卻很少衰老;既然GAB與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期以及衰老均有聯(lián)系,那么GAB是否與DNA損傷相關(guān)?我們利用IF檢測(cè)了DNA損傷的幾個(gè)標(biāo)志物(γH2AX、p-ATM、53BP1、p-Chk1、p-Chk2),發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)這幾種標(biāo)志物均形成了焦點(diǎn)樣定位,表明DNA發(fā)生了損傷,且通過(guò)對(duì)γH2AX與HP1α共染發(fā)現(xiàn),發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞即為衰老的細(xì)胞。為了驗(yàn)證細(xì)胞是否發(fā)生復(fù)制性衰老,我們通過(guò)Southern Blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在MCF-7、HT1080細(xì)胞長(zhǎng)期敲低GAB后,端粒長(zhǎng)度縮短,證明細(xì)胞發(fā)生復(fù)制性衰老。那么,GAB是如何調(diào)控端粒長(zhǎng)度的呢?我們通過(guò)Co-IP、GST Pull-Down、RIP、EMSA等實(shí)驗(yàn)技術(shù),發(fā)現(xiàn)GAB直接結(jié)合hTERT與hTR,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GAB通過(guò)其BRCT結(jié)構(gòu)域(311-415)與hTERT的500-900區(qū)段直接結(jié)合,同時(shí)GAB通過(guò)hTR介導(dǎo)結(jié)合hTERT的234-500區(qū)段與Dyskerin,通過(guò)其221-322區(qū)段結(jié)合hTR的60-360區(qū)段。GAB與端粒酶主要復(fù)合體存在相互作用,那么GAB是否可以調(diào)控端粒酶活性?我們?cè)隗w內(nèi)與體外通過(guò)TRAP實(shí)驗(yàn)均證明了GAB能夠升高端粒酶活性,其發(fā)揮功能的主要區(qū)域?yàn)锽RCT結(jié)構(gòu)域。而且GAB的IP復(fù)合體具有較高的端粒酶活性。關(guān)于端粒酶活性,最后我們?cè)贕AB轉(zhuǎn)基因鼠中也證明了轉(zhuǎn)GAB基因鼠的端粒酶活性明顯高于野生型小鼠。接下來(lái)我們研究了GAB調(diào)控端粒酶活性的具體機(jī)制。我們首先利用WB與qRT-PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)了GAB不改變hTR、h TERT、Dyskerin的表達(dá),但是通過(guò)RIP與GST Pull-Down、His Pull-Down等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了在體內(nèi)與體外GAB均通過(guò)其BRCT結(jié)構(gòu)域促進(jìn)hTR與hTERT的結(jié)合。在細(xì)胞內(nèi)敲低GAB會(huì)使端粒酶組裝復(fù)合體中許多成分的結(jié)合發(fā)生變化,敲低GAB會(huì)抑制Dyskerin與hTR、Dyskerin與hTERT的結(jié)合,但不改變負(fù)責(zé)端粒酶運(yùn)輸?shù)牡鞍譚CAB1與hTERT的結(jié)合。另外,敲低GAB會(huì)促進(jìn)hTERT在核仁的定位。由于端粒酶組裝有利于hTERT出核仁,因此,GAB能改變hTERT核仁定位的特性這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示GAB與端粒酶組裝相關(guān)。目前,已發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)hTERT與hTR結(jié)合的蛋白因子為一對(duì)ATP酶—Pontin與Reptin,通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)與TRAP實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)GAB與Pontin和Reptin之間不存在相互作用,且GAB調(diào)控端粒酶活性與Pontin和Reptin之間也沒(méi)有依賴關(guān)系,所以可以認(rèn)為GAB參與形成的端粒酶復(fù)合體不同于已報(bào)道的Pontin、Reptin參與形成的端粒酶復(fù)合體。最后,我們檢測(cè)了p53在GAB對(duì)端粒酶調(diào)控中所起的作用,首先在ZR75-1細(xì)胞中我們通過(guò)TRAP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)p53可以促進(jìn)細(xì)胞的端粒酶活性,且通過(guò)TRAP實(shí)驗(yàn)我們還發(fā)現(xiàn)了GAB調(diào)節(jié)端粒酶活性部分依賴p53。通過(guò)GST PullDown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GAB與p53存在直接相互作用。通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)證明,在HCT116p53+/+細(xì)胞中,敲低GAB后可以抑制hTERT與hTR的結(jié)合,但在HCT116 p53-/-細(xì)胞中,敲低GAB后抑制hTERT與hTR的結(jié)合能力喪失。綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)了由GAB參與的一個(gè)新的端粒酶組裝復(fù)合體,我們同時(shí)解析了GAB在端粒酶復(fù)合體中的定位與調(diào)節(jié)端粒酶組裝的機(jī)制,以及GAB發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)域。此外,我們還發(fā)現(xiàn)了GAB能調(diào)節(jié)復(fù)制性衰老,這為我們進(jìn)一步了解端粒酶及細(xì)胞復(fù)制性衰老奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞衰老 端粒酶 GAB BRCT結(jié)構(gòu)域
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R73-3;Q78
【目錄】：

• 縮略詞表7-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 前言14-20
• 材料和方法20-61
• 1 材料20-24
• 1.1 菌株與細(xì)胞株20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒20
• 1.3 實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒20-21
• 1.4 細(xì)胞培養(yǎng)試劑21
• 1.5 分子生物學(xué)試劑與其它化學(xué)試劑21-22
• 1.6 抗體22-23
• 1.7 實(shí)驗(yàn)所用的主要器材與設(shè)備儀器23-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-57
• 2.1 Southern Blotting測(cè)定端粒長(zhǎng)度24-27
• 2.2 TRAP測(cè)定端粒酶活性（選用Millipore試劑盒）27-30
• 2.3 Flag-h TERT蛋白的體外翻譯30
• 2.4 hTR及其突變體的體外轉(zhuǎn)錄30-32
• 2.5 端粒酶活性體外重構(gòu)實(shí)驗(yàn)32
• 2.6 細(xì)胞培養(yǎng)32-34
• 2.7 原代MEF細(xì)胞的分離34-35
• 2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒的包裝、感染35-38
• 2.9 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定38-39
• 2.10 Brd U摻入實(shí)驗(yàn)39
• 2.11 分子克隆39-45
• 2.12 GAB穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建45
• 2.13 蛋白印記45-48
• 2.14 Co-IP48-49
• 2.15 GST Pull-Down49-51
• 2.16 蛋白與RNA體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)51
• 2.17 RIP51-52
• 2.18 ChIP52-53
• 2.19 IF53-54
• 2.20 SA-β-Gal染色54
• 2.21 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定54-55
• 2.22 免疫組化55-56
• 2.23 RNA-EMSA56-57
• 3 在讀期間構(gòu)建的質(zhì)粒克隆57-61
• 結(jié)果61-114
• 第一部分 GAB在腫瘤與衰老中的功能研究61-71
• 1 GAB與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系61-63
• 1.1 GAB促進(jìn)端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)61-62
• 1.2 GAB與hTERT均不調(diào)控端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)62
• 1.3 敲低GAB將MCF-7 細(xì)胞周期阻滯于G1/S期62-63
• 2 GAB與DNA損傷63-65
• 2.1 長(zhǎng)期敲低GAB引起ATM 1981位與H2AX磷酸化63-64
• 2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定敲低GAB引起 53BP1在DNA損傷處聚集,并引起Chk1345位與Chk268位氨基酸磷酸化64-65
• 3 GAB與細(xì)胞衰老65-71
• 3.1 長(zhǎng)期敲低GAB引起MCF-7 細(xì)胞發(fā)生衰老65-67
• 3.2 長(zhǎng)期敲低GAB可以誘導(dǎo)衰老相關(guān)異染色質(zhì)的形成67-68
• 3.3 長(zhǎng)期敲低GAB所引發(fā)的衰老細(xì)胞與DNA損傷的細(xì)胞相同68
• 3.4 GAB調(diào)控細(xì)胞復(fù)制性衰老68-69
• 3.5 GAB不定位到端粒69
• 3.6 敲低GAB后，，hTERT定位到端粒的數(shù)量減少69-71
• 第二部分 GAB調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制性衰老的機(jī)制71-108
• 1 GAB與hTERT的相互作用及定位71-75
• 1.1 GAB與hTERT發(fā)生相互作用71
• 1.2 GAB、hTERT及其相關(guān)突變體蛋白的純化71-72
• 1.3 GAB與hTERT體外直接相互作用及定位72-74
• 1.4 GAB與TERT的相互作用不是由RNA介導(dǎo)的74-75
• 2 GAB與Dyskerin的相互作用75-76
• 2.1 GAB與Dyskerin存在相互作用且此相互作用為RNA介導(dǎo)75-76
• 2.2 GAB與Dyskerin在體外并非直接結(jié)合而是需要hTR介導(dǎo)76
• 3 GAB與hTR的相互作用及其定位76-84
• 3.1 GAB與hTR相互作用的在線預(yù)測(cè)76-78
• 3.2 GAB與hTR存在相互作用78-79
• 3.3 GAB與hTR相互作用的定位79
• 3.4 GAB與hTR在體外存在直接相互作用79-80
• 3.5 GAB與hTR在體外直接相互作用的定位80-82
• 3.6 RNA-EMSA進(jìn)一步確認(rèn)GAB與hTR在體外直接相互作用定位82-84
• 4 GAB調(diào)節(jié)端粒酶活性84-96
• 4.1 MCF-7、MEF、HT1080端粒酶活性的比較84-85
• 4.2 敲低GAB降低HT1080細(xì)胞的端粒酶活性85
• 4.3 GAB調(diào)控端粒酶活性的主要結(jié)構(gòu)域85-92
• 4.4 GAB-IP復(fù)合體具有較高的端粒酶活性92
• 4.5 GAB的含量對(duì)端粒酶活性的影響92-93
• 4.6 GAB調(diào)控端粒酶活性不依賴于Pinx193-94
• 4.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明GAB調(diào)控端粒酶活性94-96
• 5 GAB調(diào)節(jié)端粒酶活性的具體分子機(jī)制96-107
• 5.1 GAB不改變hTR的表達(dá)水平96-97
• 5.2 GAB不改變Dyskerin與hTERT的表達(dá)水平97-98
• 5.3 GAB調(diào)節(jié)hTERT與hTR結(jié)合及調(diào)節(jié)二者結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域98-100
• 5.4 GAB對(duì)hTERT與Dyskerin、hTERT與TCAB1結(jié)合的影響100-101
• 5.5 敲低GAB抑制Dyskerin與hTR的結(jié)合101-102
• 5.6 GAB、TCAB1與hTERT細(xì)胞內(nèi)定位的研究102-105
• 5.7 GAB調(diào)控端粒酶與Pontin、Reptin無(wú)關(guān)105-107
• 6 組織中端粒酶活性與GAB表達(dá)的初步探索107-108
• 第三部分 p53在GAB調(diào)控端粒酶過(guò)程中的初步探索108-114
• 1 p53、GAB與端粒酶活性108-111
• 1.1 p53促進(jìn)ZR75-1 細(xì)胞的端粒酶活性108
• 1.2 GAB調(diào)節(jié)端粒酶活性部分依賴于p53而發(fā)揮作用108-110
• 1.3 HCT116細(xì)胞中GAB調(diào)節(jié)端粒酶活性依賴于p53110-111
• 2 GAB與p53存在直接相互作用111-112
• 2.1 GAB與p53存在相互作用111
• 2.2 GAB與p53存在直接相互作用111-112
• 3 敲低GAB在HCT116 p53~(+/+)細(xì)胞中抑制hTERT與hTR的結(jié)合112-114
• 討論114-117
• 結(jié)論117-118
• 參考文獻(xiàn)118-122
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷122-123
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況123-124
• 致謝124-125

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 營(yíng)孫陽(yáng);GAB調(diào)控端粒酶組裝及腫瘤細(xì)胞衰老的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：1119360