本文關(guān)鍵詞：ABCG2特異性人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體的制備及化療增敏和放免顯像研究

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【摘要】：目的:利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)制備并篩選出ABCG2特異性全人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體,驗(yàn)證其免疫學(xué)活性、增值抑制和順鉑增敏作用,放射性核素標(biāo)記抗體后進(jìn)一步行裸鼠體內(nèi)放免顯像研究,為臨床肺腺癌的化療耐藥逆轉(zhuǎn)和分子靶向治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法與結(jié)果:第一部分單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建1.ScFv基因的合成:以肺腺癌患者癌旁陽(yáng)性淋巴結(jié)為組織來(lái)源,提組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增VH和VL基因片段。以VH和VL為模板繼續(xù)PCR,分別在其上下游加上Linker序列。等摩爾量的VH-Linker-和Linker+-VL片段經(jīng)SOE-PCR拼接成scFv片段。1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RCR產(chǎn)物大小并切膠回收各產(chǎn)物片段。結(jié)果顯示:提取的組織總RNA純度較好無(wú)降解,A260/A280比值達(dá)1.98;VH、VL、VH-Linker-、Linker+-VL及scFv產(chǎn)物大小分別為360 bp、340 bp、410 bp、390 bp和750 bp,大小與預(yù)期相符。2.初級(jí)抗體庫(kù)的制備:純化的scFv片段經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后到與噬菌體表達(dá)載體pcantab5e連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌tg1。質(zhì)粒pcr結(jié)果顯示scfv片段陽(yáng)性插入率達(dá)100%(12/12),雙酶切鑒定正確,陽(yáng)性質(zhì)粒行測(cè)序驗(yàn)證,序列比對(duì)結(jié)果與整碼的scfv編碼序列一致性可達(dá)99%。3.噬菌體抗體的表達(dá):2×yt培養(yǎng)液收集含陽(yáng)性質(zhì)粒的平板,利用m13ko7輔助噬菌體感染誘導(dǎo)scfv片段的融合表達(dá)。第二部分單鏈抗體的篩選、純化及免疫活性檢測(cè)1.a549肺腺癌細(xì)胞和abcg2純化抗原對(duì)抗體庫(kù)的聯(lián)合篩選:以a549細(xì)胞先對(duì)初級(jí)抗體庫(kù)進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的全細(xì)胞篩選,再用abcg2抗原進(jìn)行3輪固相篩選。經(jīng)過(guò)6輪篩選,抗體庫(kù)效價(jià)由首輪1.54×10-6逐輪提升至1.7×10-4,滴度提升約110倍。2.單鏈抗體scfv的可溶性表達(dá)和免疫活性鑒定:將噬菌體elisa驗(yàn)證呈陽(yáng)性的噬菌體抗體感染e.colihb2151,iptg誘導(dǎo)scfv可溶性表達(dá)。經(jīng)hitraptmanti-etag親和層析柱純化后行sds-page電泳鑒定,同時(shí)以抗e-tag抗體為一抗(1:3,000)行western-blot檢測(cè),結(jié)果顯示在34kda處有一條清晰的條帶。以非靶向scfv為對(duì)照,elisa和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)scfv的特異性發(fā)現(xiàn)該scfv與肺腺癌a549細(xì)胞的結(jié)合具有相對(duì)特異性。競(jìng)爭(zhēng)elisa結(jié)果顯示,當(dāng)抗體1:500稀釋時(shí),scfv對(duì)igg的結(jié)合抑制率為4.56%±1.96%;1:1稀釋時(shí),結(jié)合抑制率增加到68.09%±4.27%,表明該scfv對(duì)a549細(xì)胞具有較高的親和力。第三部分單鏈抗體的增殖抑制及化療增敏實(shí)驗(yàn)1.cck-8、克隆形成、遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù):單鏈抗體scfv處理a549細(xì)胞48h后進(jìn)行cck-8增殖實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)scfv對(duì)細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性抑制�？寺『瓦w移實(shí)驗(yàn)表明scfv能夠明顯抑制a549細(xì)胞的集落形成和穿膜能力。凋亡和周期結(jié)果顯示,scfv誘導(dǎo)a549細(xì)胞凋亡率明顯增加(47.95%±5.43%vs.9.21%±2.38%,p0.01),且細(xì)胞周期阻滯于g1期(70.70%±1.81%vs.52.44%±2.72%,p0.01)。2.單鏈抗體對(duì)肺腺癌細(xì)胞的化療增敏作用:a549細(xì)胞經(jīng)scfv處理后對(duì)順鉑的敏感性明顯增加,ic50值(5.31±0.49μg/mlvs.0.06±0.03μg/ml)隨scfv劑量增加而減小。3.單鏈抗體調(diào)節(jié)耐藥蛋白表達(dá):a549細(xì)胞經(jīng)不同劑量scfv處理后,提取細(xì)胞總蛋白,行westernblot檢測(cè)。結(jié)果表明scfv能夠明顯下調(diào)abcg2蛋白表達(dá),且對(duì)abc家族的其他成員mdr1也有一定的協(xié)同抑制作用。第四部分單鏈抗體的放免顯像研究采用氯胺t法對(duì)單鏈抗體scfv進(jìn)行放射性核素131i的標(biāo)記。標(biāo)記后的scfv經(jīng)尾靜脈注射至荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi),測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠體內(nèi)腫瘤及其他各組織%id/g(每克組織百分注射劑量率),并行spect/ct顯像。結(jié)果顯示:注射131i-scfv后,裸鼠體內(nèi)各組織對(duì)抗體的攝取量逐漸增加,以腫瘤組織最明顯,相應(yīng)的瘤/血、瘤/肌肉、瘤/腦的放射性比值呈逐漸升高趨勢(shì)并在第24h達(dá)到峰值(3.45±1.06、4.51±0.89和23.65±3.00),隨后逐漸降低。spect/ct融合顯像發(fā)現(xiàn)腫瘤部位具有相對(duì)特異性的放射性聚集,以第24h顯像最清楚。第五部分單鏈抗體的體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)新鮮分離的A549細(xì)胞(2×106/100μL PBS)皮下注射至裸鼠背部,當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至約500 mm3左右時(shí),將裸鼠隨機(jī)分為四組:生理鹽水NS組、單抗scFv組、順鉑DDP組和scFv+DDP聯(lián)合組(scFv 10 mg/kg,i.p.,d1-3 and DDP 2.5 mg/kg,i.p.,d 4,7.),觀察兩組腫瘤體積變化情況。收集腫瘤組織,石蠟包埋切片,以Ki-67和cleaved caspase 3抗體行免疫組化染色以檢測(cè)增殖和凋亡。結(jié)果顯示scFv+DDP聯(lián)合組瘤體明顯小于對(duì)照組且具有明顯增加的cleaved caspase 3和降低的Ki-67表達(dá)。結(jié)論:本研究以噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)為基礎(chǔ),制備并篩選出ABCG2特異性全人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體,檢測(cè)抗體的免疫活性、化療增敏和體內(nèi)外增殖抑制作用,并經(jīng)放射性核素標(biāo)記后進(jìn)一步行體內(nèi)分布研究及放免顯像研究。結(jié)果表明成功篩選出ABCG2特異性人肺腺癌單鏈抗體,具有較高親和力和特異性,能夠有效抑制肺腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增加順鉑敏感性。經(jīng)放射性核素標(biāo)記的單鏈抗體顯示出良好的動(dòng)力學(xué)特征,對(duì)靶組織的親和力高,具有較滿意的放免顯像效果,能夠?yàn)榻窈笊钊胙芯糠蜗侔┑姆琶庠\斷、靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肺腺癌 ABCG2 ScFv 化療增敏 放免顯像
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-18
• 1 材料18-22
• 2 方法22-30
• 3 結(jié)果30-32
• 4 討論32-34
• 全文總結(jié)34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 附圖表37-42
• 文獻(xiàn)綜述42-51
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 致謝51-52
• 碩士期間發(fā)表的論文52

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本文編號(hào)：1116704